D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
El hongo fitopatógeno Colletotrichum coccodes causa enfermedades peligrosas en patatas y tomates conocidas como antracnosis y mancha negra del tubérculo. Por sus características morfológicas, a menudo son difíciles de distinguir de las enfermedades causadas por otros microorganismos; en frutos de tomate verde, la enfermedad puede ser asintomática, manifestándose solo en frutos rojos maduros. Para un diagnóstico rápido y preciso del patógeno, se ofrece un sistema de prueba de PCR en tiempo real. Para desarrollar un sistema de prueba, se determinó la secuencia de nucleótidos del gen de la glicerol trifosfato deshidrogenasa de cepas de 45 C. coccodes aisladas de tubérculos de papa en diferentes regiones de Rusia.
Con base en los resultados obtenidos y el análisis de secuencias similares de otras especies disponibles en la base de datos GenBank, se diseñaron los cebadores y la sonda específicos de la especie para C. coccodes. Para comprobar la especificidad del sistema de prueba creado, se realizó PCR con ADN aislado de cultivos puros de 15 especies diferentes de hongos parásitos y saprotróficos asociados con plantas de tomate y papa (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). La presencia de ADN de Colletotrichum coccodes se determinó en un ciclo umbral de 20-27, mientras que otras especies se detectaron después de 40 ciclos o no se detectaron. El sistema de prueba permite detectar de forma fiable C. codifica concentraciones de ADN superiores a 0.01 ng / mm3 en la mezcla de PCR analizada. Utilizando el sistema de prueba desarrollado, se investigó la presencia de C. coccodes en hojas de tomate con síntomas de enfermedades fúngicas y en tubérculos de papa sin síntomas externos de la enfermedad. Las hojas con síntomas de infección por hongos se recolectaron de dos campos diferentes en el Territorio de Krasnodar, tubérculos, de campos en las regiones de Kostroma, Moscú, Kaluga, Nizhny Novgorod. Se encontró una hoja de tomate que contenía ADN de C. coccodes en el territorio de Krasnodar; Se detectó una presencia significativa de ADN de este patógeno en 5 muestras de tubérculos cultivados en las regiones de Kostroma, Moscú, Kaluga.
introducción
Los hongos del género Colletotrichum son fitopatógenos peligrosos que afectan a los cereales, hortalizas, hierbas, frutas perennes y plantas de bayas. Una de las especies ubicuas de este género, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, es el agente causante de la antracnosis y la mancha negra de las patatas y los tomates, y provoca enfermedades en varias otras plantas de la familia de las solanáceas, incl. malezas (Dillard, 1992). C. coccodes afecta todas las partes subterráneas de la planta, bases de tallos, hojas y frutos (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). En la cáscara de los tubérculos de papa infectados, se observa el desarrollo de manchas grises con bordes indistintamente pronunciados, en los que se ven claramente puntos negros de esporulación y microesclerocios. Durante el almacenamiento, se pueden formar úlceras con contenido ablandado en la pulpa de los tubérculos, es decir, la enfermedad entra en la fase de antracnosis, que, sin embargo, es extremadamente rara.
Al mismo tiempo, los síntomas de la antracnosis (úlceras cutáneas con pequeños puntos negros) son típicos de los frutos de tomate. En las hojas, los síntomas de C. coccodes aparecen como manchas de color marrón oscuro, generalmente bordeadas por tejido amarillo (Johnson, 1994).
El desarrollo de una mancha negra en los tubérculos estropea su apariencia, que es especialmente pronunciada cuando se venden patatas de piel roja lavadas. La exfoliación de la cáscara provoca una evaporación excesiva y un aumento de las pérdidas por almacenamiento (Hunger, McIntyre, 1979). El daño a otros órganos de la planta conduce a pérdidas de rendimiento, lo que se observó tanto en terrenos abiertos como cerrados (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Las enfermedades causadas por C. coccodes son comunes en casi todas las regiones productoras de papa del mundo, incluida Rusia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). El control de estas enfermedades es difícil debido a la insuficiente efectividad de los fungicidas existentes contra C. coccodes y la falta de variedades resistentes (Read, Hide, 1995).
El inóculo de C. coccodes puede persistir en tubérculos-semilla (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), semillas de tomate (Ben-Daniel et al., 2010), sobrevivir durante mucho tiempo en el suelo, en restos de plantas (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) y en malezas (Raid, Pennypacker, 1987). Los trabajos de varios autores (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) han demostrado que el desarrollo de la enfermedad en patatas y tomates depende en gran medida de la presencia de inóculo en semillas y tomates. suelo. Por lo tanto, para minimizar las pérdidas por enfermedad, es necesario diagnosticar (incluso cuantitativamente) los propágulos del hongo en el material de semilla, en el suelo, en los tubérculos de semilla de papa y semillas de tomate colocadas para almacenamiento. El diagnóstico morfológico en el suelo y el material vegetal solo se puede realizar por la presencia de microesclerocios, que, sin embargo, también se encuentran en otros tipos de hongos.
Los síntomas en los tubérculos son muy similares a la costra plateada causada por el hongo Helminthosporium solani. El aislamiento de Colletotrichum coccodes y Helminthosporium solani en un cultivo puro es bastante difícil y lleva mucho tiempo debido al lento crecimiento en un medio nutritivo. Para identificar rápidamente los coccodes de Colletotrichum, es necesario utilizar métodos de diagnóstico instrumentales. El método más conveniente es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y su modificación, la PCR en tiempo real. Actualmente, un sistema de prueba desarrollado por investigadores británicos (Cullen et al., 2002) para la región ITS1 de rDNA se utiliza en Europa y Estados Unidos. Su uso ha mostrado buenos resultados en el análisis de aislamientos rusos (Belov et al, 2018). Sin embargo, C. coccodes es muy variable y su detección a partir de una única secuencia de ADN puede dar lugar a resultados falsos negativos. Para un diagnóstico más confiable, es necesario analizar varias secuencias de ADN específicas de especies, en relación con las cuales hemos desarrollado un sistema de prueba original que nos permite identificar C. coccodes por la secuencia del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.
materiales y métodos
Para evaluar la efectividad y especificidad de los sistemas de prueba creados, utilizamos cultivos puros de 15 especies de hongos aislados por los autores de muestras enfermas de hojas y frutos de tomate, tubérculos de papa (Tabla 1). Para el aislamiento, tomamos órganos de plantas con síntomas de infección por hongos, no más de un órgano por arbusto.
Una rodaja de tubérculo con cáscara, una rodaja de fruto de tomate y una hoja afectada se colocaron bajo un microscopio binocular, después de lo cual se transfirieron micelio, esporas o un trozo de tejido a un medio de agar (agar mosto) en una placa de Petri con una aguja de disección afilada. Los aislados se almacenaron en agar inclinado en tubos de ensayo a 4 ° C.
Las muestras de hojas de tomate con síntomas de enfermedades fúngicas destinadas a análisis se colocaron inmediatamente después de la recolección (en el campo) en alcohol etílico al 70% en el que se almacenaron hasta el aislamiento del ADN. Los tubérculos de papa se entregaron al laboratorio, se pelaron (pieza de 2 × 1 cm) y se congelaron a –20 ° С. Almacenado congelado hasta el aislamiento del ADN.
Se cultivaron cultivos puros de hongos para aislamiento de ADN en medio líquido de guisantes. El micelio del hongo se retiró del medio líquido, se secó sobre papel de filtro, se congeló en nitrógeno líquido, se homogeneizó, se incubó en tampón CTAB, se purificó con cloroformo, se precipitó con una mezcla de isopropanol y acetato potásico 0.5 M, se lavó dos veces con alcohol al 2%. El ADN resultante se disolvió en agua desionizada y se almacenó a –70 ° С (Kutuzova et al., 20). La concentración de ADN se midió utilizando un kit de cuantificación de ADN HS para ADN bicatenario en Qubit 2017 (Qiagen, Alemania). Las muestras alcohólicas y congeladas se trituraron en nitrógeno líquido, luego se llevó a cabo la extracción de ADN de la misma manera que se describió anteriormente (para el micelio de cultivos fúngicos puros).
Cuadro 1. Origen de las cepas de hongos utilizadas
Nombre de la seta | Planta, órgano | Lugar de seleccion |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tubérculo de papa | Región de Kostroma, tubérculos de papa de la 1a generación de campo, cultivar Red Scarlett |
Colletotrichum cocodes 4 | hoja de papa | Reps. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helmintosporium solani | tubérculo de papa | Región de Magadán, pos. Tienda, tubérculo de patata |
Cladosporium fulvum | hoja de tomate | Región de Moscú, tomate de frutos grandes |
Alternaria tomatephila | fruta de tomate | presentado por el personal del laboratorio de micología y fitopatología del Instituto de Investigación de Protección Vegetal de toda Rusia |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | fruta de tomate | Territorio de Krasnodar, distrito de Krymsky, grado Cream |
Fusarium oxysporum | raíz de trigo | Región de Moscú. |
La PCR se realizó en un amplificador DTprime (DNA-Technology). Para la PCR, se utilizaron cebadores originales y una sonda para la región específica de especie del gen de la glicerol trifosfato deshidrogenasa: cebador directo Coc70gdf -TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, cebador inverso Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Los cebadores amplifican una región de 213 pb.
La reacción tomó 50 ng de ADN total (al analizar hojas y tubérculos) y 10 ng (al analizar ADN de cultivos de hongos puros). La mezcla de reacción (35 μl) se separó mediante una capa de parafina en dos partes: la inferior (20 μl) contenía 2 μl de tampón de reacción 10 × (Tris-HCl 750 mM, pH 8.8; (NH200) 4SO2 4 mM; MgCl25 2 mM; Tween al 0.1%. 20), 0.5 mM de cada desoxinucleótido trifosfato, 7 pmol de cada cebador y 4 pmol de una sonda fluorescente hidrolizable; el superior contenía 1 μl de tampón de PCR 10 × y 1 U de polimerasa Taq.
La separación de la mezcla con parafina permite almacenar los tubos durante mucho tiempo a una temperatura de 5 ° C y proporcionar un arranque en caliente para la PCR después de calentarlos durante 10 minutos a una temperatura superior a 80 ° C. La PCR se realizó de acuerdo con el siguiente programa: 94.0 ° C - 90 s (1 ciclo); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 ciclos); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 ciclos); 10.0 ° C - almacenamiento.
Resultados y discusión
Las secuencias del gen de la glicerol trifosfato deshidrogenasa se determinaron en 45 cepas aisladas de hojas, tallos, tubérculos de papa y frutos de tomate (Kutuzova, 2018) en diferentes regiones de Rusia. Las secuencias estudiadas de todas las cepas se dividieron en 2 grupos que se diferenciaban en dos nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos de representantes de ambos grupos con los números KY496634 y KY496635 están depositadas en GenBank.
Los cebadores coc70gdf, coc280gdr y la sonda cocgdz diseñados en base a ellos se comprobaron utilizando el programa BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) en todas las secuencias del gen de la glicerol trifosfato deshidrogenasa de especies del género Colletotrichum y otros organismos disponibles en la base de datos GenBank.
No se encontraron regiones de ADN de otros organismos altamente homólogos a los cebadores y la sonda.
La sensibilidad del sistema de prueba se verificó utilizando muestras con diferentes concentraciones de ADN de C. coccodes, ADN de una hoja de papa infectada con antracnosis (recolectada en 2017 en Mari El, variedad Red Scarlett) y piel de tubérculos afectados por mancha negra (recolectada en la región de Kostroma, variedad Red Scarlett, Cuadro 2). Para confirmar la presencia de ADN en tubérculos y hojas de papa, se aislaron cepas de C. coccodes en cultivos puros.
Los resultados del análisis de sensibilidad del sistema de prueba muestran que se puede utilizar para diagnosticar con éxito la presencia de ADN de C. coccodes en una muestra cuando su contenido total en la mezcla de PCR es superior a 0.05 ng. Esto es suficiente para la detección, ya que un esclerocio contiene, en promedio, 0.131 ng, y una espora contiene aproximadamente 0.04 ng de ADN (Cullen et al., 2002). El sistema de prueba desarrollado por el grupo inglés (Cullen et al., 2002) mostró una sensibilidad similar (ciclo umbral 34 a 0.05 ng de ADN y 37 a 0.005 ng).
El análisis de muestras naturales que contienen C. coccodes en todos los casos permitió revelar de manera confiable su presencia en la muestra (Cuadro 2). El método propuesto para el aislamiento del ADN también se aplicaba al análisis de muestras de plantas naturales.
Tabla 2. Determinación de la sensibilidad del sistema de prueba propuesto para la identificación de códigos de Colletotrichum para PCR en tiempo real
muestra | La cantidad de ADN en la muestra *, ng | Ciclo de umbral | C. detección de códigos postales |
---|---|---|---|
Micelio Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Cáscara de tubérculo 1 | 50 | 32 | + |
Cáscara de tubérculo 2 | 50 | 30 | + |
Cáscara de tubérculo 3 | 50 | 31.5 | + |
Hoja de papa | 50 | 29.5 | + |
Nota. * En una mezcla de productos de PCR.
La especificidad del sistema de prueba se verificó en muestras de ADN extraídas de 15 especies de hongos. Todas las cepas de hongos fueron aisladas por los autores de frutos y hojas sanos y afectados de tomate, tubérculos de patata; se aisló una cepa de la raíz de trigo (Tabla 1). Entre las especies aisladas de la superficie del fruto, también hay especies que no son patógenas para el tomate (por ejemplo, Phellinus ferrugineovelutinus).
Los estudios han demostrado que el ADN de C. coccodes se detectó en un ciclo umbral de 20-27, mientras que otras especies de hongos no se detectaron o dieron una señal después del ciclo 40, lo que puede atribuirse a un efecto de ruido inespecífico (Tabla 3).
Tabla 3. Prueba del sistema de prueba para varios tipos de hongos
Nombre de la seta | Ciclo de umbral |
Cocodios Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. códigos 2 | 22.6 |
C. códigos 3 | 23 |
C. códigos 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis faseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatefila | > 40 |
Helmintosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicario | > 40 |
Ilyonectria crasa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodoncio luzulae | > 40 |
penicillium sp. | > 40 |
Nota. * La cantidad de ADN en todas las muestras fue de 10 ng.
El sistema de prueba desarrollado se utilizó para identificar C. coccodes en muestras de hojas de tomate con síntomas de patógenos necrotróficos y tubérculos de semilla de papa sin síntomas visibles. Para el estudio, tomamos tubérculos-semilla de diferentes variedades cultivadas en las regiones de Kostroma, Moscú, Kaluga, Nizhny Novgorod. La presencia de ADN de C. coccodes se consideró significativa en las muestras, en cuyo análisis el ciclo umbral no superó los 35. Este valor umbral se seleccionó en base a la determinación confiable de 0.05 ng de ADN de C. coccodes (ciclo umbral 33.5, Tabla 2) y el hecho de que en ciclos umbral superiores a 40, se diagnosticó ADN inespecífico de algunas otras especies de hongos. Con este enfoque, se detectó una presencia significativa de ADN de C. coccodes en 5 muestras de tubérculos cultivados en las regiones de Kostroma, Moscú, Kaluga y en una hoja de tomate del distrito de Yeisk de la región de Krasnodar (Tablas 4, 5).
Tabla 4. Detección de colletotrichum coccodes en tubérculos de papa *
Numero de muestra | Variedad de papas | Lugar de crecimiento | C. detección de códigos postales | Ciclo de umbral |
---|---|---|---|---|
1 | Rojo escarlata | Región de Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Región de Moscú. | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky temprano | Región de Moscú. | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Región de Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasía | Región de Kaluga | - | |
15 | Gala | región de Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Nota. * La cantidad de ADN en todas las muestras fue de 50 ng.
Cuadro 5. Detección de Colletotrichum coccodes en hojas de tomate *
Numero de muestra | Lugar de crecimiento | C. detección de códigos postales | Ciclo de umbral |
---|---|---|---|
1 | Territorio de Krasnodar, distrito de Crimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Territorio de Krasnodar, distrito de Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* La cantidad de ADN en todas las muestras fue de 50 ng.
El sistema de prueba creado por nosotros no es inferior al desarrollado por investigadores británicos (Cullen et al., 2002) en sensibilidad y especificidad y es adecuado para el análisis de muestras de plantas. Su aplicación para el análisis de tubérculos-semilla permitió identificar ADN de C. coccodes en tubérculos sin signos externos de daño y analizar con éxito la infección de hojas.
Hasta la fecha, en Rusia no se ha realizado ningún análisis de los tubérculos de papa para detectar la infestación de C. coccodes. Nuestro primer estudio mostró que de los 16 tubérculos-semilla probados cultivados en diferentes regiones de la Federación de Rusia, 5 contienen C. coccodes. Esto muestra que la mancha negra de los tubérculos de papa es una enfermedad común de la papa en Rusia, y se subestima su papel en la reducción del volumen y la calidad de la cosecha de papa.
El análisis de las hojas de tomate reveló una presencia significativa de ADN de C. coccodes en una hoja del distrito de Yeisk del territorio de Krasnodar. Anteriormente, al examinar los campos de tomate en el sur de Rusia utilizando el sistema de prueba británico (Cullen et al., 2002), se encontraron hojas que contenían C. coccodes, y en algunos campos se encontró una alta proporción de hojas infectadas con C. coccodes (Belov et al., 2018). En los Territorios de Krasnodar y Primorsky, la Región de Moscú, encontramos frutos de tomate, de los cuales logramos aislar cultivos puros de C. coccodes. Es posible que C. coccodes esté mucho más extendido en el tomate en Rusia de lo que se cree actualmente, y también se subestima su nocividad.
Por tanto, hasta la fecha, se ha acumulado suficiente información sobre la distribución generalizada de C. coccodes en patatas y tomates.
Para comprender mejor el papel de este hongo en el desarrollo de enfermedades de la papa y el tomate, es necesario realizar un seguimiento exhaustivo de su prevalencia en Rusia, estudiar el papel de la infección del suelo y las semillas y el papel de la mancha negra en las pérdidas durante el almacenamiento. El uso de diagnósticos de PCR puede facilitar significativamente este trabajo, y el uso simultáneo de ambos sistemas de prueba aumentará significativamente la precisión del análisis.
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Russian Science Foundation No. 18-76-00009.
El artículo fue publicado en la revista "Mycology and Phytopathology" (volumen 54, No. 1, 2020).