COMER. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Recientemente se ha demostrado que el hongo ascomiceto Ilyonectria crassa es capaz de infectar los tubérculos de papa. Este trabajo es el primero en analizar las características biológicas y la resistencia a algunos fungicidas de la cepa I. crassa aislada de papa. Las secuencias de las regiones específicas de la especie de la cepa "papa" coincidieron con las obtenidas anteriormente para los hongos aislados de las raíces de narciso, ginseng, álamo temblón y haya, bulbos de azucena y hojas de tulipán. Aparentemente, muchas plantas silvestres y de jardín pueden ser reservas de I. crassa. La cepa investigada infectó rodajas de tomate y papa, pero no infectó la fruta entera del tomate ni el tubérculo de papa intacto. Esto muestra que I. crassa es un parásito de heridas. La evaluación de la resistencia a fludioxonil, difenoconazol y azoxistrobina en un medio nutritivo mostró una alta eficacia de estos fármacos.
El indicador EC50 (la concentración del fungicida, que ralentiza 2 veces la tasa de crecimiento radial de la colonia con respecto al control sin fungicida) fue igual a 0.4; 7.4 y 4 mg / l, respectivamente. La posibilidad del desarrollo de la enfermedad causada por I. crassa debe tenerse en cuenta al realizar la evaluación fitopatológica de los tubérculos de papa y el desarrollo de medidas fitosanitarias.
El desarrollo de microorganismos fitopatógenos conduce a grandes pérdidas en todas las etapas del cultivo y almacenamiento de las patatas. Al planificar medidas de protección, por regla general, se tienen en cuenta patógenos conocidos, como especies de los géneros Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. Sin embargo, en los últimos años, han aparecido cada vez más informes sobre la aparición de nuevos microorganismos fitopatógenos en las patatas. Su biología está poco estudiada, se desconoce la efectividad de los fungicidas utilizados en las papas en relación con ellos, no se han desarrollado métodos de diagnóstico. Con un desarrollo masivo, son capaces de causar un daño significativo al cultivo de papa. Uno de estos microorganismos es el hongo ascomiceto Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, descubierto por primera vez por los autores en tubérculos de papa (Chudinova et al., 2019).
Este trabajo presenta los resultados del análisis de la cepa I. crassa aislada de tubérculos de papa. Se estudiaron la morfología de las colonias y las estructuras miceliales de I. crassa, las secuencias de nucleótidos de las regiones de ADN específicas de la especie, la virulencia de las patatas y los tomates y la resistencia a algunos fungicidas populares.
materiales y métodos
Usamos la cepa I.crassa 18KSuPT2 aislada en 2018 del tubérculo de papa infectado cultivado en la región de Kostroma. El tubérculo se vio afectado por un tipo de podredumbre seca con una cavidad cubierta de micelio marrón claro. Usando una aguja de disección estéril, el micelio fúngico se transfirió a una placa de Petri con un medio de agar (mosto de cerveza al 10%, agar al 1.5%, penicilina 1000 U / ml). Las placas se incubaron en la oscuridad a 24 ° C.
Se utilizó un microscopio óptico Leica DM2500 con una cámara digital ICC50 HD y un microscopio binocular Leica M80 con una cámara digital IC80HD (Leica Microsystems, Alemania) para fotografiar, evaluar el tamaño y la morfología de las esporas y los órganos de las esporas.
Para aislar el ADN, el micelio fúngico se cultivó en medio líquido de guisantes, luego se congeló en nitrógeno líquido, se homogeneizó, se incubó en tampón CTAB, se purificó con cloroformo y se lavó dos veces con alcohol al 2%.
El método de extracción de ADN se describe en detalle en el artículo de Kutuzova et al. (2017).
Para determinar la especie por métodos moleculares y compararla con otras cepas conocidas de I.crassa, se realizó PCR con cebadores que permitieron la amplificación de regiones de ADN específicas de la especie: ITS1-5,8S-ITS2 (cebadores ITS5 / ITS4, White et al., 1990), regiones genéticas b -tubulina (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) y factor de elongación de la traducción 1α (tef1α) (cebadores EF1-728F / EF1-986R, Carbone y Kohn, 1999). Se extrajeron del gel amplicones de la longitud deseada utilizando el kit Evrogen CleanUp. Las regiones amplificadas se secuenciaron utilizando el kit de secuenciación de ciclos BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, CA, EE. UU.) En un secuenciador automático Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, EE. UU.). Las secuencias de nucleótidos obtenidas se utilizaron para buscar una coincidencia en la base de datos GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE. UU. (NCBI). El análisis filogenético se realizó utilizando el programa MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
La determinación de la virulencia se realizó en frutos verdes enteros de tomate de frutos grandes (variedad Dubrava) y tubérculos de papa (variedad Gala). Además, para simular el daño a las frutas y tubérculos dañados, usamos rodajas de las mismas frutas y tubérculos. Se colocaron rodajas de tubérculos en cámaras húmedas, que eran placas de Petri con papel de filtro húmedo en el fondo. Se colocó un portaobjetos sobre el papel, sobre el cual, a su vez, se colocaron rodajas de tubérculos o frutos. También se colocaron tubérculos y frutos enteros en recipientes con papel de filtro húmedo en el fondo. En el centro de la rodaja (o en la superficie intacta del tubérculo o fruto) se colocó un trozo de agar (5 × 5 mm) con hifas fúngicas después de 5 días de crecimiento en agar mosto.
La evaluación de la resistencia de las cepas de hongos a los fungicidas se llevó a cabo en condiciones de laboratorio en medio nutritivo de agar. Se estudió la susceptibilidad a los fármacos fungicidas Maxim, KS (principio activo fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxistrobina 250 g / l), Scor, EC (difenoconazol 250 g / l) (Catálogo estatal ..., 2020). La evaluación se realizó en placas de Petri en medio de mosto-agar con la adición de los fármacos estudiados a concentraciones de la sustancia activa 0.1; uno; 1 ppm (mg / L) (para fludioxonil y difenoconazol), 10; diez; 1 ppm (para azoxistrobina) y en medio sin fungicida (control). El fungicida se añadió al medio fundido y se enfrió a 10 ° C, después de lo cual se vertió el medio en placas de Petri. Se colocó un bloque de agar con micelio fúngico en el centro de una placa de Petri y se cultivó a una temperatura de 100 ° C en la oscuridad. Después de 60 días de incubación, se midieron los diámetros de las colonias en dos direcciones mutuamente perpendiculares; se promediaron los resultados de la medición para cada colonia. Los experimentos se realizaron por triplicado. Con base en los resultados de los análisis, se calculó la CE24, igual a la concentración del fungicida, que redujo a la mitad la tasa de crecimiento radial de la colonia en relación con el control fungicida.
Resultados y discusión
En placas de Petri con agar mosto, el hongo formó colonias con micelio floculante blanco. El medio debajo del micelio se volvió marrón rojizo. Cuando el medio se seca, el hongo forma esporas de dos tipos en conidióforos simples y agregados en esporodoquios pequeños. Los macroconidios son alargados, cilíndricos, con uno a tres septos, longitud promedio 27.2 µm con un rango de valores de 23.2 a 32.2 µm, ancho - hasta 4.9 µm (Fig. 1). La longitud media de los microconidios es de 14.3 µm con un rango de valores de 10.3 a 18.1 µm, el ancho es de hasta 4.0 µm. Todos los caracteres macro y micromorfológicos encajan en el rango de variación de la especie Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Las secuencias de las regiones de ADN específicas de la especie (ITS, b-tubulina, TEF 1α) coincidieron completamente con las secuencias de las cepas de I.crassa que estudiamos anteriormente (Chudinova et al., 2019, Tabla 1). Para estudiar la prevalencia de I. crassa en otras regiones y analizar el espectro de cultivos afectados, se analizaron secuencias de ADN análogas en la base de datos GenBank (Tabla 1). La superposición fue del 86 al 100%. Las secuencias de las tres regiones de ADN de la cepa de "papa" I. crassa eran idénticas a las secuencias de las cepas aisladas del bulbo de lirio y raíces de narciso en los Países Bajos y de la raíz de ginseng en Canadá. No pudimos encontrar otras cepas de I. crassa con tres secuencias similares analizadas en bases de datos abiertas. Sin embargo, el análisis de las secuencias de ITS y b-tubulina depositadas mostró la presencia de I. crassa en hojas de tulipán en el Reino Unido. Se identificaron hongos con una secuencia ITS similar en el análisis de la micobiota de raíces de álamo temblón en Canadá y raíces de haya en Italia, tubérculos de papa en Arabia Saudita (Tabla 1). Los resultados de este estudio muestran que I. crassa tiene una distribución global y es capaz de infectar varias especies de plantas.
Al determinar la patogenicidad en rodajas de tomate y papa al 5º día, el diámetro de la lesión alcanzó 1.5 cm, en este caso la cepa estudiada no infectó el fruto del tomate entero ni el tubérculo de papa intacto. Sin embargo, los sépalos se vieron afectados en el tomate. Para excluir la posibilidad de contaminación, un aislado de hongos del micelio desarrollado en una rodaja de tubérculo de papa se aisló en un cultivo puro. Era completamente idéntica a la cepa parental. Aparentemente, I. crassa es un parásito de heridas.
El tratamiento previo a la siembra de los tubérculos-semilla con fungicidas reduce el desarrollo de enfermedades en las plantas durante la temporada de crecimiento. Para la selección de fungicidas efectivos, es importante evaluar cuáles de ellos son efectivos contra I. сrassa. El trabajo estudió las sustancias activas generalizadas de los fungicidas: fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. El fludioxonil se incluye en varias mezclas que se utilizan para aderezar semillas y tubérculos de semillas antes de plantar. El fludioxonil (Maxim) también se usa para tratar los tubérculos semilla antes del almacenamiento. El difenoconazol y la azoxistrobina también se incluyen en una serie de preparaciones utilizadas para procesar material de semillas, así como en preparaciones destinadas a procesar plantas vegetativas (Catálogo estatal ..., 2020).
Se estudió la tasa de crecimiento de I.crassa en medios (Fig.2) con diferentes concentraciones de principios activos: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) y difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Tabla 2). Estas preparaciones pueden considerarse altamente efectivas contra I. crassa, ya que su CE50 es significativamente más baja que la concentración recomendada de la preparación en el fluido de trabajo utilizado para tratar los tubérculos. Según el Catálogo Estatal ... (2020), la concentración de fludioxonil en el líquido para el tratamiento de los tubérculos de papa es de 500 a 1000 ppm, azoxistrobina (en el líquido para tratar el fondo del surco) - 3750-9375 ppm, difenoconazol (en el líquido para el tratamiento de las plantas vegetativas) - 187.5– 625 ppm.
Cuadro 1. Similitud de secuencias de secuencias específicas de especies de la cepa 18KSuPT2 y cepas de Ilyonectria crassa disponibles en la base de datos Genbank
Presion | Planta hospedante, lugar de excreción | Números de secuencia depositados en GenBank, porcentaje de similitudes | Enlace | ||
SUS | β-tubulina | FET 1α | |||
17KSPT1 y 18KSuPT2 | Tubérculo de patata, región de Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, este trabajo |
CBS 158/31 | Raíces de narciso, Países Bajos | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lily Bulbo, Países Bajos | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Raíz de ginseng, Canadá | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Hoja de tulipán, Reino Unido | KJ475469 100 | KJ513266 100 | Nd | Dentón, Dentón, 2014 |
MT294410 | Raíces de álamo temblón, Canadá | MT294410 100 | Nd | Nd | Ramsfield y otros, 2020 |
ER1937 | Beech, Italia | KR019363 99.65 | Nd | Nd | Tizzani, Haegi, Motta. Envío directo |
KAUF19 | Tubérculo de patata, Arabia Saudita | HE649390 98.3 | Nd | Nd | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = no depositado
Cuadro 2. Resistencia de Ilyonectria crassa a fungicidas
(Substancia activa) | EC50, ppm | ||||
día 3 | día 5 | día 7 | |||
Controle | 17±2 | 33±5 | 47±3 | ||
Quadris, KS (fsoxistrobina) | 18±1 | 34±2 | 48±2 | ||
11±1 | 11±1 | 12±1 | |||
11±1 | 11±1 | 12±1 | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16±1 | 28±2 | 48±2 | ||
7±1 | 13±3 | 19±4 | |||
5±1 | 12±1 | 17±5 | |||
Skor, EC (difenoconazol) | 18±1 | 35±2 | 48±1 | ||
11±1 | 24±3 | 35±4 | |||
11±1 | 13±1 | 17±3 |
En nuestro trabajo, se aislaron cepas de I.crassa de tubérculos de papa en las regiones de Kostroma y Moscú (Chudinova et al., 2019). Al analizar la micobiota de los tubérculos de papa en Arabia Saudita se reveló una alta proporción de cepas fúngicas con secuencias ITS idénticas a I.crassa (Gashgari y Gherbawy, 2013). Aparentemente, I. crassa no es tan rara en las patatas como podría parecer. Nuestros experimentos demostraron que el hongo podría infectar frutos de tomate dañados. Se sabe por la literatura que I.crassa es capaz de desarrollarse en el suelo de manera saprotrófica (Moll et al., 2016), así como afectar una variedad de plantas, incluso taxonómicamente distantes como narcisos, lirios, ginseng, álamo temblón y haya (Cuadro 1). uno). Aparentemente, muchas plantas silvestres y de jardín pueden ser reservas de I. crassa. Lo anterior demuestra que al desarrollar medidas de protección, es necesario tener en cuenta la posibilidad de afectar los tubérculos de papa con este hongo. Las preparaciones generalizadas para el tratamiento de tubérculos de patata que contienen fludioxonil, azoxistrobina y difenoconazol han demostrado una alta eficacia fungicida contra I. crassa.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Rusa para la Investigación Básica (Beca No. 20-016-00139).
El artículo fue publicado en la revista "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)