S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
introducción
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, el agente causante del tizón tardío, la enfermedad económicamente más importante de la papa y el tomate, ha atraído la atención de investigadores de diferentes países durante más de siglo y medio. Apareciendo repentinamente en Europa a mediados del siglo XIX, provocó una epidemia de papa que ha quedado en la memoria de muchas generaciones.
Hasta ahora, a menudo se le llama el "hongo del hambre irlandesa". Casi cien años después de las primeras epidemias, se descubrieron especies de papa silvestre mexicana resistentes al tizón tardío, se desarrollaron métodos para cruzarlas con papas cultivadas (Muller, 1935) y se obtuvieron las primeras variedades resistentes al tizón tardío (Pushkarev, 1937). Sin embargo, poco después del inicio de su cultivo comercial, se acumularon razas del patógeno del tizón tardío que eran virulentas para las variedades resistentes. y la introducción de nuevos genes de resistencia de papas silvestres mexicanas en variedades comenzó a perder eficacia rápidamente.
Las fallas en el uso de la resistencia monogénica (vertical) obligaron a los criadores a buscar formas más complejas de explotar la resistencia poligénica (horizontal) inespecífica. En los últimos años, se han comenzado a acumular razas altamente agresivas en poblaciones individuales del parásito, lo que ha provocado la erosión de incluso resistencias inespecíficas. La llegada de cepas resistentes a los fungicidas ha causado problemas en el uso de productos químicos protectores de la papa.
Debido a las diferencias significativas entre los oomicetos y los hongos en la composición química, la ultraestructura y el metabolismo, los fungicidas, especialmente los sistémicos, utilizados para proteger las plantas de muchas enfermedades fúngicas, son ineficaces contra los oomicetos.
Por tanto, en la protección química contra el tizón tardío, se utilizaron pulverizaciones múltiples (hasta 12 veces por temporada o más) con preparaciones de contacto de amplio espectro de acción. Un paso revolucionario fue el uso de fenilamidas, que son tóxicas para los oomicetos y se propagan sistémicamente en las plantas. Sin embargo, su uso generalizado condujo rápidamente a la acumulación de cepas resistentes en poblaciones de hongos (Davidse et al., 1981), lo que complicó significativamente la protección de las plantas. P. infestans es prácticamente el único parásito de la zona templada, cuyo daño en la agricultura orgánica no se puede neutralizar sin el uso de medios químicos de protección (Van Bruggen, 1995).
Lo anterior explica la enorme atención prestada por investigadores de diferentes países al estudio de las poblaciones de P. infestans, la dinámica de su abundancia y composición genética, así como los mecanismos genéticos de variabilidad.
Ciclo de vida de R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans desarrolla un micelio intercelular con haustoria dentro de las hojas de papa. Al alimentarse de los tejidos de las hojas, provoca la formación de manchas oscuras, que se vuelven negras y se pudren en clima húmedo. Con una fuerte derrota, toda la hoja muere. Después de un período de alimentación, se forman excrecencias en el micelio, esporangióforos, que crecen hacia afuera a través de los estomas. En clima húmedo, forman una flor blanca alrededor de las manchas en la parte inferior de las hojas. En los extremos de los esporangióforos se forman zoosporangios en forma de limón, que se desprenden y son transportados por el rocío de la lluvia (Fig. 1). Al entrar en gotas de agua en la superficie de una hoja de papa, los esporangios germinan con 6-8 zoosporas, que, después de un período de movimiento, se redondean, se cubren con una cáscara y germinan con un tubo de brote. El brote penetra a través de los estomas en el tejido foliar. Bajo ciertas condiciones, los esporangios pueden crecer en un tubo de crecimiento directamente en el tejido de la hoja. En condiciones favorables, el tiempo desde la infección hasta la formación de una nueva esporulación es de solo 3-4 días.
Una vez en el suelo y filtrados a través del suelo, los esporangios son capaces de infectar los tubérculos. Los tubérculos gravemente afectados se pudren durante el almacenamiento; en los afectados débilmente, la infección puede persistir hasta la próxima temporada. Además, el agente causante del tizón tardío puede persistir en el invierno en forma de oosporas (esporas sexuales en reposo de paredes gruesas) en el suelo de los restos de plantas y semillas de tomate. Las oosporas se forman en los órganos vivos de las plantas cuando las cepas de diferentes tipos de apareamiento se encuentran con una humedad excesiva. En primavera, se forma esporulación asexual en tubérculos infectados plantados y en residuos de plantas con oosporas; las zoosporas ingresan al suelo y causan infección de las hojas inferiores de las plantas. En algunos casos, el micelio puede crecer a partir del tubérculo infectado a lo largo de la parte verde de la planta y generalmente aparece en la parte superior del tallo.
Una diferencia significativa entre los oomicetos y la mayoría de los hongos radica en el predominio de la diplofase en su ciclo de vida con meiosis gamética y la germinación de cigotos (oosporas) sin fisión nuclear reductora. Esta característica, más el heterotalismo dipolar, que reemplaza a la bisexualidad, parecería permitir aplicar a los oomicetos los enfoques desarrollados para el estudio de poblaciones de eucariotas superiores (análisis de panmixia y subdivisión de poblaciones, flujos de genes intra e interpoblacionales, etc.). Sin embargo, tres factores no permiten transferir completamente estos enfoques en el estudio de poblaciones de P. infestans.
1. Junto con las oosporas híbridas, se forman oosporas autofértiles y partenogenéticas en las poblaciones (Fife y Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), y la frecuencia de su formación puede ser suficiente para influir en los resultados de la prueba.
2. El proceso sexual en P. infestans hace una contribución insignificante a la dinámica del tamaño de la población, debido a que el hongo se reproduce principalmente por esporas vegetativas, formando más del 90% de los resultados del análisis del tipo de apareamiento por el método tradicional en un medio nutritivo. ... la temporada de crecimiento es de varias generaciones de esporulación asexual (desarrollo de enfermedad policíclica). Las oosporas juegan un papel importante en la preservación del organismo durante el período en que no hay plantas verdes (en invierno) y en la infección primaria de las plántulas. Luego, durante el verano, se produce la reproducción clonal y un aumento o, a la inversa, una disminución en el número de clones individuales que surgen como resultado de la recombinación sexual, que está determinada principalmente por la selección de los más adaptados. Por lo tanto, la proporción de clones individuales en una población al comienzo y al final de los epifitóticos puede ser completamente diferente.
3. El ciclo descrito es característico de las poblaciones nativas de P. infestans en su tierra natal, Centroamérica. En otras áreas del mundo, el proceso sexual no se conocía desde hace más de 100 años; el micelio vegetativo en los tubérculos de papa infectados era la etapa de invernada. El ciclo de vida fue completamente agámico y la propagación fue de naturaleza focal: la infección de tubérculos plantados infectados individuales pasó a las hojas, formando focos primarios de la enfermedad, que podrían fusionarse con el desarrollo masivo de la enfermedad.
Por lo tanto, en algunas regiones puede haber una alternancia de ciclos sexuales y asexuales, mientras que en otras, solo ciclo asexual.
Origen de P. INFESTANS
P. infestans apareció en Europa a finales de la primera mitad del siglo XIX. Dado que la papa es originaria del noreste de América del Sur, se asumió que el parásito fue traído de allí a Europa durante el auge del salitre chileno. Sin embargo, estudios llevados a cabo en la estación de papa del Rockefeller Center en el Valle de Toluca, México, obligaron a revisar este punto de vista (Niederhauser 1991, 1993).
1. En el Valle de Toluca, las especies locales de papa tuberosa (Solanum demissum, S. bulbocastanum, etc.) tienen diferentes conjuntos de genes de resistencia vertical combinados con un alto nivel de resistencia inespecífica, lo que indica una larga coevolución con el parásito. Las especies sudamericanas, incluidas las papas cultivadas, carecen de genes de resistencia.
2. En el Valle de Toluca existen aislamientos con los tipos de apareamiento A1 y A2, por lo que la población mestiza de P. infestans está muy extendida; mientras que en la tierra natal de la papa cultivada, América del Sur, el parásito se propaga clonalmente.
3. En el Valle de Toluca, hay epidemias anuales severas de tizón tardío. Por tanto, entre los investigadores norteamericanos (Universidad de Cornell), se establece la opinión sobre Mesoamérica (Centroamérica) como cuna de la papa phytophthora (Goodwin et al., 1994).
Los investigadores sudamericanos no comparten esta opinión. Creen que la papa cultivada y su parásito P. infestans tienen una patria común: los Andes sudamericanos. Apoyaron su punto de vista mediante estudios moleculares sobre el análisis de polimorfismos de ADN del genoma mitocondrial (mtDNA) y genes nucleares RAS y β-tubulina (Gomez-Alpizar et al., 2007). Demostraron que las cepas recolectadas de diferentes partes del mundo descienden de tres líneas ancestrales divergentes, que (las tres) se encuentran en los Andes sudamericanos. Los haplotipos andinos son descendientes de dos líneas: los aislamientos del linaje de ADNmt más antiguo se encuentran en las solanáceas silvestres de la sección Anarrhicomenum en Ecuador, mientras que los aislamientos de la segunda línea son comunes en las papas, los tomates y las solanáceas silvestres. En Toluca, incluso los haplotipos raros descienden de un solo linaje, y la variabilidad genética de las cepas de Toluca (baja frecuencia alélica de algunos sitios variables) indica un fuerte efecto fundador debido a la deriva reciente.
Además, en los Andes se encontró una nueva especie P. andina, morfológica y genéticamente similar a P. infestans, que, según los autores, apunta a los Andes como un punto caliente de especiación en el género Phytophthora. Finalmente, en Europa y Estados Unidos, las poblaciones de P. infestans incluyen ambos linajes andinos, mientras que en Toluca solo uno.
Esta publicación provocó la respuesta de un grupo de investigadores de diferentes países, quienes hicieron mucho trabajo experimental para revisar el estudio realizado anteriormente (Goss et al., 2014). En este trabajo, en primer lugar, se utilizaron secuencias de ADN de microsatélites más informativas para estudiar polimorfismos de ADN; en segundo lugar, para el análisis de agrupaciones, trayectorias migratorias, divergencia temporal de poblaciones, etc. se utilizaron modelos más avanzados (estadísticos F, aproximaciones bayesianas, etc.) y, en tercer lugar, se utilizó una comparación no solo con la especie andina P. andina, en la que se estableció una naturaleza híbrida (P. infestans x Phytophthora sp.) pero también con las especies endémicas mexicanas P. mirabilis, P. Ipomoeae y Phytophthora phaseoli, que son P. infestans genéticamente cercanas incluidas en el mismo clado (Kroon et al., 2012). Como resultado de estos análisis, se demostró de manera inequívoca que la parte de la raíz del árbol filogenético de todas las especies del género Phytophthora tomadas en el estudio, excepto el híbrido P. andina, pertenece a cepas mexicanas, y el flujo de migración tiene la dirección México - Andes, y no viceversa, y su inicio coincide con el europeo. colonización del Nuevo Mundo (hace 300-600 años). Así, la aparición de la especie P. infestans especializada para la derrota de la papa se produjo en el centro genético secundario de la formación de plantas solanáceas tuberosas, es decir. en Centroamérica.
Genoma de P. INFESTANS
En 2009, un equipo internacional de científicos secuenció el genoma completo de P infestans (Haas et al, 2009), cuyo tamaño era de 240 MB. Esto es varias veces más que en las especies estrechamente relacionadas P. sojae (95 Mb), que provocan la pudrición de las raíces de la soja, y P. Ramorum (65 Mb), que afecta a especies arbóreas tan valiosas como el roble, el haya y algunas otras. Los datos obtenidos mostraron que el genoma contiene una gran cantidad de copias de secuencias repetidas: 74%. El genoma contiene 17797 genes que codifican proteínas, la mayor parte de los cuales son genes involucrados en procesos celulares, incluida la replicación del ADN, la transcripción y la traducción de proteínas.
La comparación de genomas del género Phytophthora reveló una organización inusual del genoma que consta de bloques de secuencias de genes conservados, en los que la densidad de genes es relativamente alta y el contenido de secuencias repetidas es relativamente bajo, y regiones individuales con secuencias de genes no conservadas, con una baja densidad de genes y un alto contenido de regiones repetidas. Los bloques conservadores representan el 70% (12440) de todos los genes codificadores de proteínas de P. infestans. Dentro de los bloques conservadores, los genes suelen estar estrechamente espaciados con una distancia intergénica media de 604 pb. En áreas entre bloques conservadores, la distancia intergénica es mayor (3700 bp) debido a un aumento en la densidad de elementos repetidos. Los genes secretores efectores de rápida evolución se encuentran en regiones pobres en genes.
El análisis de la secuencia del genoma de P. Infestans mostró que aproximadamente un tercio del genoma pertenece a elementos transponibles. El genoma de P. infestans contiene familias de transposones significativamente más diferentes que otros genomas conocidos. La mayoría de los transposones de P. infestans pertenecen a la familia Gypsy.
En el genoma de P. infestans, se ha identificado un gran número de familias de genes específicas implicadas en la patogénesis. Una parte significativa de ellos codifica proteínas efectoras que cambian la fisiología de la planta huésped y contribuyen a su infección. Pertenecen a dos amplias categorías: efectores apoplásicos, que actúan en los espacios intercelulares (apoplastos), y efectores citoplásmicos, que entran en las células a través de la haustoria. Los efectores apoplásticos incluyen enzimas hidrolíticas secretadas tales como proteasas, lipasas y glicosilasas que destruyen las células vegetales; inhibidores de las enzimas de defensa de la planta huésped y toxinas necrotizantes como las proteínas similares a Nep1 (NPL) y las proteínas pequeñas ricas en cisteína (SCR) similares a la Pcf.
Los genes efectores de P. infestans son numerosos y generalmente más grandes que los genes no patógenos. Los más conocidos son los efectores citoplasmáticos RXLR y Crinkler (CNR). Los efectores citoplasmáticos típicos de los oomicetos son las proteínas RXLR. Todos los genes efectores RXLR descubiertos hasta ahora contienen el grupo amino-terminal Arg-XLeu-Arg, donde X es un aminoácido. Como resultado del estudio, se sugirió que hay 563 genes RXLR en el genoma de P. infestans, que es un 60% más que en P. sojae y P. ramorum. Aproximadamente la mitad de los genes RXLR en el genoma de P. infestans son específicos de especie. Los efectores RXLR tienen una amplia variedad de secuencias. Entre ellos, se identificaron una familia grande y 150 pequeñas. A diferencia del proteoma principal, los genes efectores RXLR suelen estar ubicados en regiones del genoma pobres en genes y ricas en repeticiones. Los elementos móviles que determinan el dinamismo de estas regiones facilitan la recombinación en estos genes.
Los efectores citoplasmáticos de CRN se identificaron originalmente en transcripciones de P. infestans que codifican péptidos de necrosis de tejidos vegetales. Desde su descubrimiento, se ha sabido poco sobre la familia de estos efectores. El análisis del genoma de P. Infestans reveló una enorme familia de 196 genes CRN, que es significativamente más grande que en P. sojae (100 CRN) y P. ramorum (19 CRN). Al igual que los RXLR, los CRN son proteínas modulares y consisten en un dominio LFLAK N-terminal altamente conservado (50 aminoácidos) y un dominio DWL adyacente que contiene diferentes genes. La mayoría de los CRN (60%) poseen un péptido señal.
Se ha estudiado la posibilidad de que varios CRN interrumpan los procesos celulares de la planta huésped. Al analizar la necrosis vegetal, la eliminación de las proteínas CRN2 permitió identificar la región C-terminal que consta de 234 aminoácidos (posiciones 173-407, dominio DXG) y que provoca la muerte celular. El análisis de los genes CRN de P. infestans reveló cuatro regiones C-terminales diferentes, que también causan la muerte celular dentro de la planta. Estos incluyen los dominios DC recientemente identificados (P. infestans tiene 18 genes y 49 pseudogenes), así como los dominios D2 (14 y 43) y DBF (2 y 1) que son similares a las proteínas quinasas. Las proteínas de los dominios CRN expresados en una planta se conservan (en ausencia de péptidos señal) en una célula vegetal y estimulan la muerte celular mediante un mecanismo intracelular. Es muy probable que otras 255 secuencias que contienen dominios CRN no funcionen como genes.
El aumento en el número y tamaño de las familias de genes efectores RXLR y CRN se debió presumiblemente a recombinación homóloga no alélica y duplicación de genes. A pesar de que el genoma contiene una gran cantidad de elementos móviles activos, todavía no hay evidencia directa de la transferencia de genes efectores.
Métodos utilizados en el estudio de la estructura poblacional
El estudio de la estructura genética de las poblaciones se basa actualmente en el análisis de cultivos puros de sus cepas constituyentes. El análisis de poblaciones sin aislar cultivos puros también se realiza con fines específicos, como por ejemplo, estudiar la agresividad de una población o la presencia de cepas resistentes a fungicidas en ella (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Este tipo de investigación implica el uso de métodos especiales, cuya descripción está fuera del alcance de esta revisión. Para el análisis comparativo de cepas, se utilizan varios métodos basados tanto en el análisis de la estructura del ADN como en el estudio de las manifestaciones fenotípicas. El análisis comparativo de poblaciones tiene que tratar con un gran número de aislamientos, lo que impone ciertos requisitos a los métodos utilizados. Idealmente, deberían cumplir los siguientes requisitos (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- ser baratos, fáciles de implementar, no requerir costos de tiempo significativos, estar basados en tecnologías generalmente disponibles (por ejemplo, PCR);
- debe generar un número suficientemente grande de características de marcadores codominantes independientes;
- tener una alta reproducibilidad;
- utilizar la cantidad mínima de tejido que se va a examinar;
- ser específico del sustrato (la contaminación presente en el cultivo no debe afectar los resultados);
- no requieren el uso de procedimientos peligrosos y productos químicos altamente tóxicos.
Desafortunadamente, no hay métodos que correspondan a todos los parámetros anteriores. Para un estudio comparativo de las cepas en nuestro tiempo, se utilizan métodos basados en el análisis de rasgos fenotípicos: virulencia a variedades de papa y tomate (razas de papa y tomate), tipo de apareamiento, espectros de isoenzimas de peptidasa y glucosa-6-fosfato isomerasa, y en análisis de estructura del ADN: polimorfismo de longitud fragmento de restricción (RFLP), que generalmente se complementa con una sonda de hibridación RG 57, análisis de repeticiones de microsatélites (SSR e InterSSR), amplificación con cebadores aleatorios (RAPD), amplificación de fragmentos de restricción (AFLP), amplificación con cebadores homólogos a las secuencias de elementos móviles (por ejemplo, Inter SINE PCR), determinación de haplotipos de ADN mitocondrial.
Breves descripciones de los métodos de estudio comparativo de cepas utilizados en el trabajo con P. Infestans
Rasgos de marcadores fenotípicos
Carreras de "patatas"
Las razas de "patatas" son un marcador comúnmente investigado y utilizado. Las razas de "papa simple" tienen un gen para la virulencia de la papa, las "complejas", al menos dos. Black et al. (1953), resumiendo todos los datos disponibles, encontraron que la raza phytophthora es capaz de infectar plantas con el gen / genes de resistencia correspondientes al gen / genes de virulencia de P. infestans, y encontraron las razas 1, 2, 3 y 4 que infectan plantas. con los genes R1, R2, R3 y R4, respectivamente, es decir la interacción entre el parásito y el huésped se produce según el principio gen por gen. Además, Black, con la participación de Gallegly y Malcolmson, descubrió los genes de resistencia R5, R6, R7, R8, R9, R10 y R11, así como las razas correspondientes (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Existe una gran cantidad de datos sobre la composición racial del patógeno de diferentes regiones. Sin analizar estos datos en detalle, indicaremos solo una tendencia general: donde se usaron variedades con nuevos genes de resistencia o sus combinaciones, al principio hubo algún debilitamiento del tizón tardío, pero luego aparecieron las razas con los genes de virulencia correspondientes y se seleccionaron y se reanudaron los brotes de tizón tardío. Rara vez se observó virulencia específica contra los primeros 4 genes de resistencia (R1-R4) en las colecciones recolectadas antes de la introducción en el cultivo de variedades con estos genes, pero el número de cepas virulentas aumentó drásticamente cuando el patógeno parasitó las variedades portadoras de estos genes. Los genes 5-11, por otro lado, eran bastante comunes en las colecciones (Shaw, 1991).
Un estudio de la proporción de diferentes razas durante la temporada de crecimiento, realizado a fines de la década de 1980, mostró que al inicio del desarrollo de la enfermedad predominan en la población los clones con baja agresividad y 1-2 genes de virulencia.
Además, con el desarrollo del tizón tardío, la concentración de los clones originales disminuye y aumenta el número de razas "complejas" con alta agresividad. La ocurrencia de este último al final de la temporada alcanza el 100%. Al almacenar tubérculos, hay una disminución de la agresividad y una pérdida de genes de virulencia individuales. La dinámica del reemplazo de clones puede ocurrir en diferentes variedades de diferentes formas (Rybakova & Dyakov, 1990). Sin embargo, nuestros estudios en 2000-2010 han demostrado que las razas complejas se encuentran desde el comienzo mismo de las epifitóticas entre las cepas aisladas tanto de patatas como de tomates. Probablemente esto se deba a un cambio en las poblaciones de P. infestans en Rusia.
En 1988-1995, la aparición de "superrazas" con todos o casi todos los genes de virulencia en diferentes regiones alcanzó el 70-100%. Esta situación se observó, por ejemplo, en Bielorrusia, en las regiones de Leningrado, Moscú, Osetia del Norte y Alemania (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Carreras de "tomates"
En los cultivares de tomate, solo se encontraron 2 genes de resistencia al tizón tardío: Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) y Ph2 (Al-Kherb, 1988). Como en el caso de las razas de patatas, la interacción entre los tomates y P. infestans se produce gen por gen. La raza T0 infecta a variedades que no tienen genes de resistencia (la mayoría de las variedades utilizadas industrialmente), la raza T1 infecta a las variedades con el gen Ph1 (Ottawa) y la raza T2 infecta a las variedades con el gen Ph2.
En Rusia, casi exclusivamente T0 se encontró en las patatas; T0 predominó en los tomates al comienzo de la temporada, pero luego fue reemplazado por la raza T1 (Dyakov et al., 1975, 1994). Después de 2000, la T1 en la papa en muchas poblaciones comenzó a ocurrir al comienzo del período epifitótico. En los Estados Unidos, las cepas de papa no fueron patógenas para el tomate, así como las razas T0, T1 y T2, mientras que T1 y T2 prevalecieron en los tomates (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Tipo de apareamiento
Para realizar el estudio, se requieren cepas de prueba (referencia) con tipos de apareamiento conocidos: A1 y A2. El aislado de prueba se inocula con ellos por parejas en placas de Petri con medio de agar avena. Después de la incubación durante 10 días, las placas se examinan para detectar la presencia o ausencia de oosporas en el medio en la zona de contacto de las cepas. Hay 4 opciones: la cepa pertenece al tipo de apareamiento A1, si forma oosporas con el probador A2, a A2, si forma oosporas con el probador A1, a A1A2, si forma oosporas con ambos probadores, o es estéril (00), si no forma oosporas sin probador (los dos últimos grupos son raros).
Para determinar más rápidamente los tipos de apareamiento, se intentó identificar regiones del genoma asociadas con el tipo de apareamiento, con el objetivo de seguir utilizándolas para determinar el tipo de apareamiento por PCR. Uno de los primeros experimentos exitosos para identificar tal sitio fue realizado por investigadores estadounidenses (Judelson et al., 1995). Usando el método RAPD, pudieron identificar la región W16 asociada con el tipo de apareamiento en la descendencia de dos aislados cruzados y diseñar un par de cebadores de 24 pb para amplificarla (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') y W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Después de la restricción del producto de PCR con la enzima de restricción HaeIII, fue posible separar los aislamientos con los tipos de apareamiento A1 y A2.
Investigadores coreanos realizaron otro intento de obtener marcadores de PCR para determinar los tipos de apareamiento (Kim, Lee, 2002). Identificaron productos específicos utilizando el método AFLP. Como resultado, se desarrollaron un par de cebadores PHYB-1 (directo) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') y PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), lo que permite la amplificación selectiva de la región del genoma asociada con el tipo de apareamiento A2. Posteriormente, continuaron con este trabajo y diseñaron los cebadores 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, forward) y 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), permitiendo la amplificación selectiva de la región Mat-A1, característica de cepas con tipo de apareamiento A1. El uso de diagnósticos por PCR de los tipos de apareamiento mostró buenos resultados al estudiar poblaciones de P. infestans en la República Checa (Mazakova et al., 2006), Túnez (Jmour, Hamada, 2006) y otras regiones. En nuestro laboratorio (Mytsa, Elansky, inédito), se analizaron 34 cepas de P. infestans aisladas de órganos enfermos de papa y tomate en diferentes regiones de Rusia (Kostroma, Ryazan, Astrakhan y Moscú). Los resultados del análisis de PCR utilizando cebadores específicos más del 90% coincidieron con los resultados del análisis del tipo de apareamiento por el método tradicional en un medio nutritivo.
Tabla 1. Variabilidad de la resistencia dentro del clon Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Lugar de recogida de muestras | Número de aislamientos analizados | Número de cepas sensibles (S), débilmente resistentes (SR) y resistentes (R), pcs (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Ciudad de ekaterimburgo | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Región de Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Resistencia al metalaxilo como marcador de población
A principios de la década de 1980, se observaron en varias regiones poderosos brotes de tizón tardío causado por cepas de P. infestans resistentes al metalaxilo. Las granjas de papa en muchos países han sufrido pérdidas significativas (Dowley y O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Desde entonces, en muchos países del mundo, se ha realizado un seguimiento constante de la aparición de cepas resistentes a fenilamida en poblaciones de P. infestans. Además de una evaluación práctica de las perspectivas del uso de fármacos que contienen fenilamida, la construcción de un sistema de medidas de protección y la predicción de epifitotias, la resistencia a estos fármacos se ha convertido en una de las características de los marcadores ampliamente utilizados para el análisis comparativo de poblaciones de este patógeno. Sin embargo, el uso de resistencia al metalaxilo en estudios comparativos de población debe realizarse teniendo en cuenta que: 1 - la base genética de la resistencia aún no se ha determinado con precisión, 2 - la resistencia al metalaxilo es un rasgo selectivamente dependiente que puede cambiar según el uso de fenilamidas, 3 - diferentes el grado de sensibilidad a las cepas de metalaxilo dentro de una línea clonal (Tabla 1).
Espectros de isoenzimas
Los marcadores de isoenzimas suelen ser independientes de las condiciones externas, muestran herencia mendeliana y son codominantes, lo que permite distinguir entre homocigotos y heterocigotos. El uso de proteínas como marcadores genéticos permite identificar grandes reorganizaciones del material genético, incluidas mutaciones cromosómicas y genómicas, y sustituciones de un solo aminoácido.
Los estudios electroforéticos de proteínas han demostrado que la mayoría de las enzimas existen en los organismos en forma de varias fracciones que difieren en la movilidad electroforética. Estas fracciones son el resultado de codificar múltiples formas de enzimas por diferentes loci (isoenzimas o isoenzimas) o por diferentes alelos del mismo locus (aloenzimas o aloenzimas). Es decir, las isoenzimas son diferentes formas de una enzima. Las diferentes formas tienen la misma actividad catalítica, pero difieren ligeramente en las sustituciones de un solo aminoácido en el péptido y en la carga. Estas diferencias se revelan durante la electroforesis.
Al estudiar cepas de P. infestans, se utilizan los espectros de isoenzimas de dos proteínas, peptidasa y glucosa-6-fosfato isomerasa (esta enzima es monomórfica en poblaciones rusas, por lo tanto, los métodos de su estudio no se presentan en este trabajo). Para separarlos en isoenzimas en un campo eléctrico, las preparaciones de proteínas aisladas de los organismos estudiados se aplican a una placa de gel colocada en un campo eléctrico. La velocidad de difusión de las proteínas individuales en el gel depende de la carga y el peso molecular; por lo tanto, en un campo eléctrico, la mezcla de proteínas se separa en fracciones separadas, que se pueden visualizar con colorantes especiales.
El estudio de las isoenzimas de peptidasa se realiza sobre geles de acetato de celulosa, almidón o poliacrilamida. El más conveniente es el método basado en el uso de geles de acetato de celulosa fabricados por Helena Laboratories Inc. No requiere grandes cantidades de materiales de prueba, permite obtener bandas contrastantes en el gel después de la electroforesis para ambos loci enzimáticos, su implementación no requiere grandes costos de tiempo y material (Fig. 2).
Se transfiere una pequeña pieza de micelio a un microtubo de 1,5 ml, se le agregan 1-2 gotas de agua destilada. Después de eso, la muestra se homogeneiza (por ejemplo, con un taladro eléctrico con un accesorio de plástico adecuado para un microtubo) y se sedimenta durante 25 segundos en una centrífuga a 13000 rpm. 8 μl de cada microtubo. el sobrenadante se transfiere a la placa aplicadora.
El gel de acetato de celulosa se retira del recipiente de tampón, se seca entre dos hojas de papel de filtro y se coloca con la capa de trabajo hacia arriba sobre la base de plástico del aplicador. El aplicador transfiere la solución de la placa al gel de 2 a 4 veces. El gel se transfiere a una cámara de electroforesis,
Tabla 2. La composición de la solución utilizada para teñir el gel de acetato de celulosa en el análisis de isoenzimas de peptidasa, se coloca una gota de pintura (azul de bromofenol) en el borde del gel.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidasa, 1000 U / ml 5 gotas
o-dianisidina, 4 mg / ml 8 gotas
MgCl2, 20 mg / ml 2 gotas
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 gotas
L-aminoácido oxidasa, 20 u / ml 2 gotas
La electroforesis se realiza durante 20 minutos. a 200 V. Después de la electroforesis, el gel se transfiere a una mesa de pintura y se pinta con una solución de pintura especial (Tabla 2). Se funden preliminarmente 10 ml de agar DIFCO al 1,6% en un horno microondas, se enfría a 60ºC, después de lo cual se mezclan 2 ml de agar con una mezcla de pintura y se vierten sobre el gel. Las rayas aparecen en 15-20 minutos. El reactivo de L-aminoácido oxidasa se agrega justo antes de mezclar la solución con agar fundido.
En las poblaciones rusas, el locus Pep 1 está representado por los genotipos 100/100 y 92/100. El homocigoto 92/92 es extremadamente raro (alrededor del 0,1%). Locus Rehr 2 está representado por tres genotipos 100/100, 100/112 y 112/112, y las 3 variantes son bastante comunes (Elanky y Smirnov, 2003, Fig. 2).
Investigación del genoma
Polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción con hibridación posterior (RFLP-RG 57)
El ADN total se trata con la enzima de restricción Eco R1, los fragmentos de ADN se separan por electroforesis en gel de agarosa. El ADN nuclear es muy grande y tiene muchas secuencias repetitivas, por lo que es difícil analizar directamente los numerosos fragmentos obtenidos por la acción de las enzimas de restricción. Por lo tanto, los fragmentos de ADN separados en el gel se transfieren a una membrana especial y se utilizan para la hibridación con la sonda RG 57, que incluye nucleótidos marcados con marcadores radiactivos o fluorescentes. Esta sonda se hibrida con secuencias genómicas repetitivas (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Después de la visualización de los resultados de la hibridación en un material ligero o radiactivo, se obtiene un perfil de hibridación de múltiples locus (huella dactilar), representado por 25-29 fragmentos (Forbes et al., 1998). La descendencia asexual (clonal) tendrá los mismos perfiles. La disposición de las bandas en el electroforetograma se utiliza para juzgar las similitudes y diferencias de los organismos comparados.
Haplotipos de ADN mitocondrial
En la mayoría de las células eucariotas, el mtDNA se presenta en forma de una molécula de ADN circular bicatenaria que, a diferencia de los cromosomas nucleares de las células eucariotas, se replica de forma semiconservadora y no está asociada con moléculas de proteína.
Se secuenció el genoma mitocondrial de P. infestans y se dedicaron varios trabajos al análisis de la longitud de los fragmentos de restricción (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Después de que Griffith y Shaw (1998) desarrollaron un método simple y rápido para determinar los haplotipos de ADNmt, este marcador se convirtió en uno de los más populares en los estudios de P. Infestans. F2-R2 (Tabla 4) y su posterior restricción con las enzimas de restricción MspI (4er fragmento) y EcoR3 (1do fragmento). El método le permite identificar 1 haplotipos: Ia, IIa, Ib, IIb. El tipo II se diferencia del tipo I por la presencia de un inserto de 2 pb de tamaño y por una ubicación diferente de los sitios de restricción en las regiones P4 y P1881 (Fig. 2).
Desde 1996, entre las cepas recolectadas en el territorio de Rusia, solo se observaron los haplotipos Ia y IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Pueden identificarse después de la separación de los productos de restricción con el cebador F2-R2 en un campo eléctrico (Fig. 4, 5). Los tipos de ADNmt se utilizan en el análisis comparativo de cepas y poblaciones. En varios trabajos, se utilizaron tipos de ADN mitocondrial para aislar líneas clonales y pasaportar aislamientos de P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Utilizando el método PCR-RFLP, se concluyó que el mtDNA es heterogéneo en la misma cepa de P. infestans (Elansky y Milyutina, 2007). Condiciones de amplificación: 1x (500 seg. 94 ° C), 40x (30 seg. 90 ° C, 30 seg. 52 ° C, 90 seg. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Mezcla de reacción: (20 μl): 0,2 U Taq ADN polimerasa, 1 tampón MgCl2,5-Taq 2 mM, 0,2 mM cada dNTP, cebador 30 pM y 5 ng del ADN analizado, agua desionizada - hasta 20 μl.
La restricción del producto de PCR se lleva a cabo durante 4-6 horas a una temperatura de 37 ° C. Mezcla de restricción (20 μl): 10x MspI (2 μl), tampón de restricción 10x (2 μl), agua desionizada (6 μl), producto de PCR (10 μl).
Tabla 3. Cebadores utilizados para la amplificación de regiones polimórficas de mtDNA
Lugar | Primer | Longitud y colocación del cebador | Longitud del producto de PCR | Restrictasa |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | mspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Amplificación de cebador aleatorio (RAPD)
Al realizar RAPD, se usa un cebador (a veces varios cebadores simultáneamente) con una secuencia de nucleótidos arbitraria, generalmente de 10 nucleótidos de longitud, con un alto contenido (desde el 50%) de nucleótidos de GC y una baja temperatura de hibridación (aproximadamente 35 ° C). Dichos cebadores "aterrizan" en numerosos sitios complementarios del genoma. Después de la amplificación, se obtienen una gran cantidad de amplicones. Su número depende de los cebadores usados y las condiciones de reacción (concentración de MgCl2 y temperatura de hibridación).
La visualización de amplicones se realiza mediante destilación en gel de poliacrilamida o agarosa. Al realizar un análisis RAPD, es necesario controlar cuidadosamente la pureza del material analizado, porque La contaminación con otros objetos vivos puede provocar un aumento significativo en el número de artefactos, que son bastante numerosos incluso en el análisis de material puro (Pérez et al, 1998). El uso de este método en el estudio del genoma de P. infestans se refleja en muchos trabajos (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). La selección de las condiciones de reacción y los cebadores (se estudiaron 51 cebadores de 10 nucleótidos) se proporciona en el artículo de Abu-El Samen et al., (2003).
Análisis de repetición de microsatélites (SSR)
Las repeticiones de microsatélites (repeticiones de secuencia simple, SSR) son secuencias cortas repetidas en tándem de 1-3 (a veces hasta 6) nucleótidos presentes en los genomas nucleares de todos los eucariotas. El número de repeticiones sucesivas puede variar de 10 a 100. Los loci de microsatélites ocurren con una frecuencia bastante alta y están distribuidos más o menos uniformemente por todo el genoma (Lagercrantz et al., 1993). El polimorfismo de las secuencias de microsatélites se asocia con diferencias en el número de repeticiones del motivo básico. Los marcadores microsatélites son codominantes, lo que permite utilizarlos para analizar la estructura de la población, determinar el parentesco, las rutas de migración de genotipos, etc. Entre otras ventajas de estos marcadores, cabe destacar su alto polimorfismo, buena reproducibilidad, neutralidad y la capacidad de realizar análisis y evaluación automáticos. El análisis del polimorfismo de las repeticiones de microsatélites se realiza mediante amplificación por PCR utilizando cebadores complementarios a secuencias únicas que flanquean loci de microsatélites. Inicialmente, el análisis se realizó con la separación de los productos de reacción en un gel de poliacrilamida. Posteriormente, los empleados de la empresa Applied Biosystems propusieron utilizar cebadores marcados con fluorescencia con la detección de productos de reacción utilizando un detector láser automático (Diehl et al., 1990), y luego secuenciadores de ADN automáticos estándar (Ziegle et al., 1992). El etiquetado de imprimaciones con varios tintes fluorescentes permite analizar varios marcadores a la vez en un carril y, en consecuencia, aumenta significativamente la productividad del método y aumenta la precisión del análisis.
Las primeras publicaciones dedicadas al uso del análisis de SSR para el estudio de P. infestans aparecieron a principios de la década de 2000. (Knapova, Gisi, 2002). No todos los marcadores propuestos por los autores mostraron un grado suficiente de polimorfismo, sin embargo, dos de ellos (4B y G11) fueron incluidos en el conjunto de 12 marcadores SSR propuestos por Lees et al. (2006) y posteriormente adoptados en la red de investigación Eucablight (www.eucablight .org) como estándar para P. infestans. Unos años más tarde, se publicó un estudio sobre la creación de un sistema de análisis multiplex de ADN de P. infestans basado en ocho marcadores SSR (Li et al., 2010). Finalmente, después de evaluar todos los marcadores propuestos anteriormente y seleccionar el más informativo de ellos, así como optimizar los cebadores, los marcadores fluorescentes y las condiciones de amplificación, el mismo equipo de autores presentó un sistema para el análisis multiplex de un solo paso, que incluía 12 marcadores (Tabla 4; Li et al. , 2013a). Los cebadores utilizados en este sistema se seleccionaron y marcaron con uno de los cuatro marcadores fluorescentes (FAM, VIC, NED, PET) de modo que los rangos de los tamaños de los alelos de los cebadores con los mismos marcadores no se superpusieran.
Los autores realizaron el análisis en un amplificador PTC200 (MJ Research, EE. UU.) Utilizando kits de PCR multiplex de QIAGEN o kits de PCR de microsatélites Typeit de QIAGEN. El volumen de la mezcla de reacción fue de 12.5 µl. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: para QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); para QIAGEN Type-it Microsatélite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 seg), 58 ° C (90 seg), 72 ° C (20 seg), 60 ° C (30 min).
La separación y visualización de los productos de la PCR se llevó a cabo utilizando un analizador de ADN capilar automático ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabla 4. Características de 12 marcadores SSR estándar utilizados para el genotipado de P. infestans (Li et al., 2013a)
nombre | Numero de alelos | Rango de tamaño alelos (bp) | Imprimaciones |
cerdo11 | 13 | 130 - 180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255 - 275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325 - 360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100 - 185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250 - 275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280 - 305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160 - 175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185 - 205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230 - 250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265 - 280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165 - 180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200 - 295 | F: MASCOTA-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Un ejemplo de visualización de los resultados del análisis se muestra en la Fig. 6. Los resultados se analizaron utilizando el software GeneMapper 3.7 comparando los datos obtenidos con los datos de aislados conocidos. Para facilitar la interpretación de los resultados del análisis, es necesario incluir 1-2 aislados de referencia con un genotipo conocido en cada estudio.
El método de investigación propuesto se probó en un número significativo de muestras de campo, tras lo cual los autores estandarizaron protocolos entre laboratorios de dos organizaciones, The James Hutton Institute (Reino Unido) y Wageningen University & Research (Países Bajos), que, junto con la posibilidad de utilizar tarjetas FTA estándar para La recolección y envío de muestras de ADN de P. infestans permitió hablar sobre la posibilidad de uso comercial de este desarrollo. Además, un método rápido y preciso de genotipado de aislamientos de P. infestans utilizando análisis SSR multiplex permitió realizar estudios estandarizados de poblaciones de este patógeno a escala global, y la creación de una base de datos mundial sobre el tizón tardío en el marco del proyecto Eucablight (www.eucablight.org), que incluye , incluidos los resultados del análisis de microsatélites, permitió rastrear la aparición y propagación de nuevos genotipos en todo el mundo.
Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción amplificado (AFLP). AFLP (polimorfismo de longitud de fragmento amplificado) es una tecnología para generar marcadores moleculares aleatorios utilizando cebadores específicos. En AFLP, el ADN se trata con una combinación de dos enzimas de restricción. Los adaptadores específicos se ligan a los extremos pegajosos de los fragmentos de restricción.
A continuación, estos fragmentos se amplifican utilizando cebadores complementarios a la secuencia adaptadora y al sitio de restricción, y además portan una o más bases aleatorias en sus extremos 3 '. El conjunto de fragmentos obtenidos depende de las enzimas de restricción y de los nucleótidos seleccionados al azar en los extremos 3 'de los cebadores (Vos et al., 1995). AFLP: el genotipado se utiliza para estudiar rápidamente la variación genética de varios organismos.
Una descripción detallada del método se da en los trabajos de Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Investigadores chinos han llevado a cabo mucho trabajo comparando la resolución de los métodos AFLP y SSR. Se estudiaron las características fenotípicas y genotípicas de 48 aislamientos de P. infestans recolectados en cinco regiones del norte de China. Los espectros AFLP revelaron ocho genotipos de ADN diferentes, en contraste con los genotipos SSR, para los cuales no se encontró diversidad (Guo et al., 2008).
Amplificación con cebadores homólogos a las secuencias de elementos móviles
Los marcadores derivados de secuencias de retrotransposones son muy convenientes para el mapeo genético, el estudio de la diversidad genética y los procesos evolutivos (Schulman, 2006). Si se fabrican cebadores para complementar las secuencias estables de ciertos elementos móviles, es posible amplificar las regiones del genoma ubicadas entre ellos. En estudios sobre el agente causante del tizón tardío, se utilizó con éxito el método de amplificación de las regiones del genoma utilizando un cebador complementario a la secuencia central de la retroazona SINE (Elementos nucleares intercalados cortos) (Lavrova y Elansky, 2003). Con este método, se revelaron diferencias incluso en la descendencia asexual de un aislado. En este sentido, se concluyó que el método de PCR inter-SINE es altamente específico y la tasa de movimiento de los elementos SINE en el genoma de Phytophthora es alta.
En el genoma de P. infestans, se han identificado 12 familias de retrotransposones cortos (SINE); Se investigó la distribución de especies de retrotransposones cortos, se identificaron elementos (SINE) que se encuentran en el genoma de P. infestans únicamente (Lavrova, 2004).
Características de la aplicación de métodos de estudio comparativo de cepas en estudios de población.
Al planificar un estudio, es necesario comprender claramente los objetivos que persigue y utilizar los métodos adecuados. Por tanto, algunos métodos permiten generar un gran número de signos marcadores independientes, pero al mismo tiempo tienen baja reproducibilidad y dependen en gran medida de los reactivos utilizados, las condiciones de reacción y la contaminación del material de prueba. Por tanto, en cada estudio de un grupo de cepas, es necesario utilizar varios aislados estándar (de referencia), pero incluso en este caso, los resultados de varios experimentos son muy difíciles de combinar.
Este grupo de métodos incluye RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Después de la amplificación, se obtienen una gran cantidad de fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Es aconsejable utilizar estas técnicas cuando sea necesario establecer diferencias entre cepas estrechamente relacionadas (parental-descendiente, mutantes de tipo salvaje, etc.), o en los casos en que se requiera un análisis detallado de una pequeña muestra. Por tanto, el método AFLP se utiliza ampliamente en el mapeo genético de P. infestans (van der Lee et al., 1997) y en estudios intrapoblacionales (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Estos métodos no son prácticos al crear bases de datos de cepas, ya que es prácticamente imposible unificar la contabilidad de los resultados al realizar análisis en diferentes laboratorios.
A pesar de la aparente simplicidad y velocidad de ejecución (aislamiento de ADN sin buena purificación, amplificación, visualización de resultados), este grupo de métodos requiere el uso de un método especial para documentar los resultados: destilación en gel de poliacrilamida con cebadores marcados (radiactivos o luminiscentes) y posterior exposición a luz o material radiactivo. La formación de imágenes en gel de agarosa con bromuro de etidio convencional generalmente no es adecuada para estos métodos porque se pueden fusionar una gran cantidad de fragmentos de ADN de diferentes tamaños.
Otros métodos, por el contrario, le permiten generar una pequeña cantidad de características con una reproducibilidad muy alta. Este grupo incluye el estudio de los haplotipos de ADN mitocondrial (solo se observan dos haplotipos Ia y IIa en Rusia), el tipo de apareamiento (la mayoría de los aislamientos se subdividen en 2 tipos: A1 y A2, rara vez se encuentran SF autofértiles) y espectros de isoenzimas de peptidasa (dos loci Pep1 y Pep2 , que consta de dos isoenzimas cada una) y glucosa-6-fosfato isomerasa (en Rusia no existe variabilidad para este rasgo, aunque se observa un polimorfismo significativo en otros países del mundo). Es recomendable utilizar estas funciones al analizar colecciones, compilar bases de datos regionales y globales. En el caso del análisis de isoenzimas y haplotipos de ADN mitocondrial, es posible prescindir en absoluto de cepas estándar, mientras que en el análisis de tipos de apareamiento, se requieren dos aislados de prueba con tipos de apareamiento conocidos.
Las condiciones de reacción y los reactivos solo pueden afectar el contraste del producto en el electroforetograma; la manifestación de artefactos en este tipo de estudios es poco probable.
Actualmente, la mayoría de las poblaciones en la parte europea de Rusia están representadas por cepas de ambos tipos de apareamiento (Tabla 6), entre ellas existen aislamientos con los tipos Ia y IIa de ADN mitocondrial (otros tipos de ADNmt encontrados en el mundo no se han encontrado en Rusia después de 1993). Los espectros de las isoenzimas peptidasa están representados por dos genotipos en el locus Pep1 (100/100, 92/92 y heterocigoto 92/100, y el genotipo 92/92 es extremadamente raro (<0,3%)) y por dos genotipos en el locus Pep 2 (100/100 , 112/112 y heterocigoto 100/112, con el genotipo 112/112 ocurriendo con menos frecuencia que 100/100, pero también con bastante frecuencia).
No hubo variabilidad en el espectro de isoenzimas de la glucosa-6-fosfato isomerasa después de 1993 (la desaparición de la línea clonal US-1); todos los aislamientos estudiados tenían el genotipo 100/100 (Elansky y Smirnov, 2002).
El tercer grupo de métodos permite obtener un grupo suficiente de características de marcadores independientes con alta reproducibilidad. En la actualidad, este grupo incluye la sonda RFLP-RG57, que produce entre 25 y 29 fragmentos de ADN de diferentes tamaños. RFLP-RG57 se puede utilizar tanto para analizar muestras como para compilar bases de datos. Sin embargo, este método es mucho más caro que los anteriores, lleva mucho tiempo y requiere una cantidad suficientemente grande de ADN altamente purificado. Por lo tanto, el investigador se ve obligado a limitar el volumen del material probado.
El desarrollo de RFLP-RG57 a principios de los años 90 del siglo pasado intensificó significativamente los estudios poblacionales del agente causante del tizón tardío. Se convirtió en la base del método basado en la selección y análisis de "líneas clonales" (ver más abajo). Junto con RFLP-RG57, el tipo de apareamiento, la huella de ADN (método RFLP-RG57), los espectros de isoenzimas de peptidasa y glucosa-6-fosfato isomerasa y el tipo de ADN mitocondrial se utilizan para identificar líneas clonales. Gracias a él, se demostró al., 1994), se identificaron el reemplazo de poblaciones antiguas por nuevas (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), y los linajes clonales que prevalecen en muchos países del mundo. Los estudios de cepas rusas que utilizaron este método mostraron un alto polimorfismo genotípico de cepas en la parte europea y monomorfismo de poblaciones en las partes de Asia y el Lejano Oriente de Rusia (Elansky et al, 2001). Y ahora este método sigue siendo el principal en los estudios de población de P. infestans. Sin embargo, su amplia distribución se ve obstaculizada por su alto costo y la intensidad laboral en la ejecución.
Otra técnica prometedora que rara vez se utiliza en los estudios de P. infestans es el análisis de repetición de microsatélites (SSR). Actualmente, este método se usa ampliamente para aislar líneas clonales. Para el análisis de cepas, se utilizaron ampliamente (y se siguen utilizando) rasgos de marcadores fenotípicos como la presencia de genes de virulencia en variedades de patata (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) y el tomate. A estas alturas, los genes de virulencia de las variedades de papa han perdido su valor como rasgos marcadores para los estudios de población debido a la aparición del número máximo (o cercano) de genes de virulencia en la gran mayoría de los aislamientos. Al mismo tiempo, el gen de virulencia T1 para cultivares de tomate que llevan el gen Ph1 correspondiente todavía se utiliza con éxito como rasgo marcador (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
En muchos estudios, la resistencia a los fungicidas se utiliza como marcador. Este rasgo no es deseable para usar en estudios de población debido a la aparición bastante fácil de mutaciones de resistencia en líneas clonales después de la aplicación de fungicidas que contienen metalaxil- (o mefenoxam-) en el campo. Por ejemplo, se mostraron diferencias significativas en el nivel de resistencia dentro de la línea clonal Sib1 (Elansky et al., 2001).
Por tanto, el tipo de apareamiento, el espectro de la isoenzima peptidasa, el tipo de ADN mitocondrial, RFLP-RG57, SSR son marcadores preferidos para crear bancos de datos y etiquetar cepas en colecciones. Para comparar muestras limitadas, si es necesario utilizar el número máximo de características del marcador, puede utilizar AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tabla 5). Sin embargo, debe recordarse que estos métodos son poco reproducibles, y en cada experimento individual (ciclo de electroforesis de amplificación), se deben utilizar varios aislados de referencia.
Cuadro 5. Comparación de diferentes métodos de investigación de cepas P. infestans
criterio | TC | Policías isofer | ADNmt | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Cantidad de información | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproducibilidad | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Posibilidad de artefactos | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
costo de | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensidad laboral | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Velocidad de análisis ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Nota: H - bajo, C - medio, B - alto; НС * - la intensidad del trabajo es baja cuando se usa gel de agarosa o automático
genotyper, medio - por destilación en gel de poliacrilamida con cebadores etiquetados,
** - sin contar el tiempo dedicado a cultivar micelio para el aislamiento del ADN.
Estructura poblacional
Líneas clonales
En ausencia de recombinación o de su contribución insignificante a la estructura de la población, la población consiste en un cierto número de clones, los intercambios genéticos entre los cuales son extremadamente raros.
En tales poblaciones, es más informativo estudiar no las frecuencias de genes individuales, sino las frecuencias de genotipos que tienen un origen común (líneas clonales o linajes clonales) y difieren solo en mutaciones puntuales. Los estudios de población del patógeno del tizón tardío y el análisis de las líneas clonales se han acelerado significativamente desde la llegada del método RFLP-RG57 a principios de los años 90 del siglo pasado. Junto con RFLP-RG57, el tipo de apareamiento, los espectros de isoenzimas de peptidasa y glucosa-6-fosfato isomerasa, y el tipo de ADN mitocondrial se utilizan para identificar líneas clonales. Las características de las líneas clonales más comunes se muestran en la Tabla 6.
El clon US-1 dominó las poblaciones en todas partes hasta finales de la década de 80, después de lo cual comenzó a ser reemplazado por otros clones y desapareció de Europa y América del Norte. Ahora se encuentra en el Lejano Oriente (Filipinas, Taiwán, China, Japón, Corea, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), en África (Uganda, Kenia, Ruanda, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al. al., 2000; Ochwo et al., 2002) y en América del Sur (Ecuador, Brasil, Perú, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). No se han identificado cepas pertenecientes a la línea US-1 solo en Australia. Aparentemente, los aislados de P. infestans llegaron a Australia con otra ola de migración (Goodwin, 1997).
El clon US-6 migró del norte de México a California a fines de la década de 70 y causó una epidemia en papas y tomates después de 32 años sin enfermedades. Debido a su alta agresividad, desplazó al clon US-1 y comenzó a dominar la costa occidental de Estados Unidos (Goodwin et al., 1995a).
Los genotipos US-7 y US-8 fueron descubiertos en los Estados Unidos en 1992 y ya en 1994 estaban ampliamente distribuidos en Estados Unidos y Canadá. Durante una temporada de campo, el clon US-8 puede desplazar casi por completo al clon US-1 en parcelas de papa infectadas inicialmente con ambos clones en igual concentración (Miller y Johnson, 2000).
Se han identificado clones BC-1 a BC-4 en Columbia Británica en un pequeño número de aislados de Goodwin et al., 1995b). El clon US-11 se extendió ampliamente en los Estados Unidos y suplantó al US-1 en Taiwán. Los clones JP-1 y EC-1, junto con el clon US-1, son comunes en Japón y Ecuador, respectivamente (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 es un clon que prevaleció en Rusia sobre un vasto territorio desde la región de Moscú hasta Sakhalin. En la región de Moscú, fue descubierto en 1993, y algunas poblaciones de campo consistieron principalmente en cepas de esta línea clonal, altamente resistentes al metalaxil. Después de 1993, la prevalencia de este clon disminuyó significativamente. Fuera de los Urales en 1997-1998, SIB-1 se encontró en todas partes, con la excepción del Territorio de Khabarovsk (el clon SIB-2 está muy extendido allí). La separación espacial de clones con diferentes tipos de apareamiento excluye el proceso sexual en Siberia y el Lejano Oriente. En la región de Moscú, a diferencia de Siberia, la población está representada por muchos clones; casi todos los aislamientos tienen un genotipo multilocus único (Elansky et al., 2001, 2015). Esta diversidad no puede explicarse únicamente por la importación de cepas del hongo de diferentes partes del mundo con material de semilla importado. Dado que ambos tipos de apareamiento ocurren en la población, es posible que su diversidad también se deba a la recombinación. Por tanto, en Columbia Británica, se supone la aparición de los genotipos BC-2, BC-3 y BC-4 debido a la hibridación de los clones BC-1 y US-6 (Goodwin et al., 1995b). Es posible que se encuentren cepas híbridas en poblaciones de Moscú. Por ejemplo, las cepas MO-4, MO-8 y MO-11 heterocigotas para el locus PEP pueden ser híbridos entre las cepas MO-12, MO-21, MO-22, que tienen el tipo de emparejamiento A2 y homocigotas para un alelo del locus PEP y la cepa MO-8, que tiene el tipo de apareamiento A1 y homocigoto para otro alelo del locus. Y si este es el caso, y en las poblaciones modernas de P. infestans hay una tendencia a un aumento en el papel del proceso sexual, entonces el valor informativo del análisis de clones multilocus disminuirá (Elansky et al., 2001, 2015).
Variación en líneas clonales
Hasta los años 90 del siglo XX, la línea clonal US-20 estaba muy extendida en el mundo. La mayoría de las poblaciones regionales y de campo consistieron exclusivamente en cepas con el genotipo US-1. Sin embargo, también se observaron diferencias entre los aislamientos, muy probablemente causadas por un proceso mutacional. Las mutaciones ocurrieron tanto en el ADN nuclear como en el mitocondrial y afectaron, entre otras cosas, el nivel de resistencia a los fármacos fenilamidas y el número de genes de virulencia. Las líneas que difieren de los genotipos originales por mutaciones se indican mediante números adicionales después del punto que sigue al nombre del genotipo original (por ejemplo, la línea mutante US-1 de la línea clonal US-1.1). Las líneas de ADN de huellas dactilares US-1 y US-1.5 contienen líneas accesorias de diferentes tamaños (Goodwin et al., 1.6a, 1995b); la línea clonal US-1995 también difiere de la US-6.3 en una línea accesoria (Goodwin, 6, Tabla 1997).
En el estudio del ADN mitocondrial, se encontró que en la línea clonal US-1 solo se encuentra el tipo 1b de ADN mitocondrial (Carter et al., 1990). Sin embargo, en el estudio de cepas de este linaje clonal de Perú y Filipinas, se encontraron aislados cuyos tipos de ADN mitocondrial diferían del 1b por la presencia de inserciones y deleciones (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Cuadro 6. Genotipos multilocus de algunas líneas clonales de P. infestans
nombre | Tipo de apareamiento | Isoenzimas | Huellas dactilares de ADN | Tipo de ADNmt | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
CE-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Nota: * - sin datos.
Cuadro 7. Genotipos multilocus y sus líneas mutantes
nombre | Tipo de apareamiento | | Huellas de ADN (RG57) | Notas | |
GPI | pep-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Genotipo original 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutación en PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutación en RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutación en RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutación en RG57 y PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutación en RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Genotipo original 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutación en PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutación en RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutación en RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutación en RG57 y PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutación en RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Genotipo original 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutación en RG57 |
También hay cambios en los espectros de isoenzimas. Por regla general, son causados por la descomposición de un organismo inicialmente heterocigótico para esta enzima en homocigotos. En 1993, en frutos de tomate, identificamos una cepa con características típicas de la US-1: huellas dactilares RG57, tipo de ADN mitocondrial y genotipo 86/100 para glucosa-6-fosfatizomerasa, pero era homocigótica (100/100) para el primer locus de peptidasa en lugar de un heterocigoto 92/100 típico de esta línea clonal. Nombramos el genotipo de esta cepa MO-17 (Tabla 6). Las líneas mutantes US-1.1 y US-1.4 también difieren de la US-1 por mutaciones en el primer locus de peptidasa (Tabla 7).
Las mutaciones que provocan cambios en el número de genes de virulencia de las variedades de patata y tomate son bastante comunes. Se observaron entre aislamientos de la línea clonal US-1 en poblaciones de los Países Bajos (Drenth et al., 1994), Perú (Goodwin et al., 1995a), Polonia (Sujkowski et al., 1991), norte de América del Norte (Goodwin et al., ., 1995b). También se observaron diferencias en el número de genes de virulencia de la papa entre los aislados de las líneas clonales US-7 y US-8 en Canadá y Estados Unidos (Goodwin et al., 1995a), entre los aislados de la línea SIB-1 en la parte asiática de Rusia (Elansky et al, 2001). ).
Los aislamientos con fuertes diferencias en los niveles de resistencia a los fármacos fenilamidas se identificaron en poblaciones de campo monoclonales, todas las cuales pertenecían a la línea clonal Sib-1 (Elansky et al, 2001, Tabla 1). Casi todas las cepas de la línea clonal US-1 son muy sensibles al metalaxilo; sin embargo, se aislaron cepas muy resistentes de esta línea en Filipinas (Koh et al., 1994) y en Irlanda (Goodwin et al., 1996).
Poblaciones modernas de P. infestans
América Central (México)
La población de P. infestans en México difiere notablemente de otras poblaciones mundiales, lo que se debe principalmente a su posición histórica. Numerosos estudios de esta población y especies afines de P. infestans del clado Phytophthora, así como especies locales del género Solanum, llevaron a la conclusión de que la evolución del patógeno en la parte central de México se produjo junto con la evolución de las plantas hospedadoras y se asoció con la recombinación sexual (Grünwald, Flier , 2005). Ambos tipos de apareamiento están representados en la población, y en proporciones iguales, y la presencia de oosporas en el suelo, en plantas y tubérculos de papa y especies afines silvestres Solanum confirma la presencia de un proceso sexual en la población (Fernández-Pavía et al., 2002). Estudios recientes del Valle de Toluca y sus alrededores (el presunto centro de origen del patógeno) confirmaron la alta diversidad genética de la población local de P. infestans (134 genotipos multilocus en una muestra de 176 muestras) y la presencia de varias subpoblaciones diferenciadas en la región (Wang et al., 2017). Los factores que contribuyen a esta diferenciación son la división espacial de subpoblaciones características de las tierras altas del centro de México, las diferencias en las condiciones de cultivo y variedades de papa utilizadas en valles y montañas, y la presencia de especies silvestres de Solanum tuberosa que pueden actuar como hospedadores alternativos (Fry et al. ., 2009).
Sin embargo, cabe señalar que las poblaciones de P. infestans en el norte de México son más bien clonales y más similares a las poblaciones norteamericanas, lo que puede indicar que estos son los nuevos genotipos (Fry et al., 2009).
América del Norte
Las poblaciones norteamericanas de P. infestans siempre han tenido una estructura muy simple y su carácter clonal se estableció mucho antes del uso del análisis de microsatélites. Hasta 1987, la línea clonal US-1 dominaba en Estados Unidos y Canadá (Goodwin et al., 1995). A mediados de la década de 70, cuando aparecieron los fungicidas a base de metalaxilo, este clon comenzó a ser reemplazado por otros genotipos más resistentes que migraron desde México (Goodwin et al., 1998). A finales de los 90. el genotipo US-8 reemplazó completamente al genotipo US-1 en los Estados Unidos y se convirtió en la línea clonal dominante en las papas (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). La situación era diferente con los tomates, que contenían constantemente varias líneas clonales, y su composición cambiaba de un año a otro (Fry et al., 2009).
En 2009, estalló una epidemia a gran escala de tizón tardío en los Estados Unidos en los tomates. Una característica de esta pandemia fue su aparición casi simultánea en muchos lugares del noreste de los Estados Unidos, y resultó estar asociada con ventas masivas de plántulas de tomate infectadas en grandes centros de jardinería (Fry et al., 2013). Las pérdidas de cosechas fueron enormes. El análisis de microsatélites de las muestras afectadas reveló que la cepa pandémica pertenecía al tipo de apareamiento de la línea clonal US-22 A2. En 2009, la proporción de este genotipo en la población estadounidense de P. infestans alcanzó el 80% (Fry et al., 2013). En los años siguientes, la proporción de genotipos agresivos US-23 (principalmente en tomates) y US-24 (en papas) aumentó constantemente en la población; sin embargo, después de 2011, la tasa de detección de US-24 disminuyó significativamente y, hasta la fecha, alrededor del 90% de la población de patógenos en Estados Unidos está representado por el genotipo US-23 (Fry et al., 2015).
En Canadá, como en Estados Unidos, a finales de los 90. el genotipo dominante US-1 fue reemplazado por el US-8, cuyas posiciones dominantes permanecieron sin cambios hasta 2008. En Canadá, hubo graves epidemias de tizón tardío asociadas con la venta de plántulas de tomate infectadas, pero fueron causadas por los genotipos US-2009 y US-2010 (Kalischuk et al., 23). La clara diferenciación geográfica de estos genotipos fue notable: la US-8 dominó las provincias occidentales de Canadá (2012%), mientras que la US-23 dominó las provincias orientales (68%). En los años siguientes, la US-8 se extendió a las regiones orientales; sin embargo, en general, su participación en la población disminuyó ligeramente en el contexto de la aparición de los genotipos US-83 y US-23 en el país (Peters et al., 22). Hasta la fecha, US-24 mantiene una posición dominante en todo Canadá; La US-2014 está presente en Columbia Británica, mientras que la US-23 y la US-8 están presentes en Ontario (Peters, 23).
Por tanto, las poblaciones norteamericanas de P. infestans son principalmente líneas clonales. En los últimos 40 años, el número de genotipos clonales detectados ha llegado a 24. A pesar de que existen cepas de ambos tipos de apareamiento en la población, la probabilidad de aparición de nuevos genotipos como resultado de la recombinación sexual sigue siendo bastante baja. Sin embargo, en los últimos 20 años se han registrado varios casos de aparición de poblaciones recombinantes efímeras (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), y en un caso, el resultado del cruce fue el genotipo US-11. , que estuvo arraigada en América del Norte durante muchos años (Gavino et al., 2000). Hasta 2009, los cambios en la estructura de las poblaciones estaban asociados con la aparición de nuevos genotipos más agresivos con su posterior migración y desplazamiento de predecesores previamente dominantes. Qué pasó en 2009-2010 En los EE. UU. Y Canadá, las epifitóticas mostraron por primera vez que en la era de la globalización, los brotes de la enfermedad pueden asociarse con la propagación activa de nuevos genotipos al vender material de siembra infectado.
Sudamérica
Hasta hace poco, los estudios de las poblaciones sudamericanas de P. infestans no eran regulares ni a gran escala. Se sabe que la estructura de estas poblaciones es bastante simple e incluye de 1 a 5 linajes clonales por país (Forbes et al., 1998). Entonces, para 1998, los genotipos US-1 (Brasil, Chile) BR-1 (Brasil, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Perú y Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 y AR-5 (Argentina), PE-3 y PE-7 (sur de Perú). El tipo de apareamiento A2 estuvo presente en Brasil, Bolivia y Argentina y no se encontró más allá de la frontera boliviano-peruana en el área del lago Titicaca, detrás del cual el genotipo EC-1 A1 dominaba en los Andes. En tomates, US-1 siguió siendo el genotipo dominante en toda Sudamérica.
La situación persistió más o menos en la década de 2000. Un punto importante fue el descubrimiento de una nueva línea clonal EC-2 del tipo A2 en parientes silvestres de la papa (S. brevifolium y S. tetrapetalum) en los Andes del Norte (Oliva et al., 2010). Estudios filogenéticos han demostrado que esta línea no es completamente idéntica a P. infestans, aunque está estrechamente relacionada con ella, en relación con la cual se propuso considerarla, así como otra línea, EC-3, aislada del árbol de tomate S. betaceum que crece en los Andes, una nueva especie llamada P. andina; sin embargo, el estado de esta especie (una especie independiente o un híbrido de P. infestans con alguna línea aún desconocida) aún no está claro (Delgado et al., 2013).
Actualmente, todas las poblaciones sudamericanas de P. infestans son clonales. A pesar de la presencia de ambos tipos de apareamiento, no se han identificado poblaciones recombinantes. En los tomates, el genotipo US-1 es ubicuo, aparentemente desplazado de las papas por cepas locales, cuyo origen exacto aún se desconoce. En Brasil, Bolivia y Uruguay, el genotipo BR-1 está presente; en Perú, junto con US-1 y EC-1, existen varios otros genotipos locales. En los Andes, la posición dominante la mantiene la línea clonal EC-1, cuya relación con P. andina, recientemente descubierta, permanece inexplorada. El único lugar "inestable" donde para el período 2003-2013. hubo cambios significativos en la población, se convirtió en Chile (Acuña et al., 2012), donde en 2004-2005. la población de patógenos se caracterizó por la resistencia al metalaxilo y un nuevo haplotipo de ADN mitocondrial (Ia en lugar del Ib previamente presente). 2006 hasta 2011 En la población, dominó el genotipo 21 (según SSR), cuya participación alcanzó el 90%, luego de lo cual la palma pasó al genotipo 20, cuya frecuencia de ocurrencia en los dos años siguientes se mantuvo en alrededor del 67% (Acuña, 2015).
Europa
En la historia de Europa, ha habido al menos dos oleadas de migración de P. infestans desde América del Norte: en el siglo XIX. (HERB-1) y principios del siglo XX (US-1). La distribución ubicua de fungicidas que contienen metalaxilo en los años 70. condujo al desplazamiento del genotipo dominante US-1 y su reemplazo por nuevos genotipos. Como resultado, en la mayoría de los países de Europa occidental, las poblaciones del patógeno estuvieron representadas principalmente por varias líneas clonales.
El uso del análisis de microsatélites para el análisis de poblaciones de patógenos permitió revelar los cambios graves que se produjeron en Europa occidental en 2005-2008. En 2005, se descubrió una nueva línea clonal en el Reino Unido, denominada 13_A2 (o "Blue 13") y caracterizada por el tipo de apareamiento A2 , alta agresividad y resistencia a fenilamidas (Shaw et al., 2007). El mismo genotipo se encontró en muestras recolectadas en 2004 en los Países Bajos y el norte de Francia, lo que sugirió que migró al Reino Unido desde Europa continental, posiblemente con semillas de papa (Cooke et al., 2007). El estudio del genoma de representantes de esta línea clonal mostró un alto grado de polimorfismo de su secuencia (para 2016, el número de sus variaciones subclonales alcanzó 340) y un grado significativo de variación en el nivel de expresión génica, incl. genes efectores durante la infección de plantas (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Estas características, junto con la mayor duración de la fase biotrófica, podrían causar una mayor agresividad de 13_A2 y su capacidad para infectar incluso variedades de papa resistentes al tizón tardío.
En los años siguientes, el genotipo se extendió rápidamente por los países del noroeste de Europa (Gran Bretaña, Irlanda, Francia, Bélgica, Holanda, Alemania) con el desplazamiento simultáneo de los genotipos previamente dominantes 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Según el sitio web www.euroblight.net, la participación de 13_A2 en las poblaciones de estos países alcanzó el 60-80% y más; La presencia de este genotipo también se ha registrado en algunos países del este y sur de Europa. Sin embargo, en 2009-2012. 13_A2 perdió sus posiciones dominantes en Gran Bretaña y Francia, cediendo a la línea 6_A1 (8_A1 en Irlanda), y en los Países Bajos y Bélgica fue reemplazada parcialmente por los genotipos 1_A1, 6_A1 y 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Hasta la fecha, aproximadamente el 70% de la población de P. infestans de Europa occidental es monoclonal. Según el sitio web www.euroblight.net, los genotipos dominantes en los países del noroeste de Europa (Reino Unido, Francia,
Holanda, Bélgica) permanecen, aproximadamente en proporciones iguales, 13_A2 y 6_A1, y este último prácticamente no ocurre fuera de la región especificada (con la excepción de Irlanda), pero ya tiene al menos 58 subclones (Cooke, 2017). Las variaciones 13_A2 están presentes en números notables en Alemania, y también se observan esporádicamente en los países de Europa Central y Meridional. El genotipo 1_A1 constituye una parte significativa de las poblaciones de Bélgica y, en parte, de los Países Bajos y Francia. El genotipo 8_A1 se ha estabilizado en la población europea en el nivel del 3-6%, a excepción de Irlanda, donde mantiene su posición de liderazgo y se divide en dos subclones (Stellingwerf, 2017). Finalmente, en 2016, se observó un aumento en la frecuencia de ocurrencia de los nuevos genotipos 36_A2 y 37_A2, registrados por primera vez en 2013-2014; hasta la fecha, estos genotipos se encuentran en los Países Bajos y Bélgica y en parte en Francia y Alemania, así como en la parte sur de Gran Bretaña (Cooke, 2017). Aproximadamente el 20-30% de la población de Europa occidental está representada por genotipos únicos cada año.
A diferencia de Europa occidental, cuando apareció el genotipo 13_A2, las poblaciones del norte de Europa (Suecia, Noruega, Dinamarca, Finlandia) no estaban representadas por líneas clonales, sino por una gran cantidad de genotipos únicos (Brurberg et al.,
2011). Durante el período de propagación activa de 13_A2 en Europa Occidental, la presencia de este genotipo en Escandinavia no se notó hasta 2011, cuando se descubrió por primera vez en el norte de Jutlandia (Dinamarca), donde se cultivan principalmente variedades de papa industrial con el uso activo de metalaxilo. fungicidas (Nielsen et al., 2014). Según www.euroblight.net, el genotipo 13_A2 también se detectó en varias muestras de Noruega y Dinamarca en 2014 y en varias muestras noruegas en 2016; Además, en 2013, se observó en Finlandia la presencia del genotipo 6_A1 en una pequeña cantidad. Se considera que la principal razón del fracaso de 13_A2 y otras líneas clonales en la conquista de Escandinavia son las diferencias climáticas de esta región con los países de Europa Occidental.
Además del hecho de que los veranos frescos y los inviernos fríos contribuyen a la supervivencia de las oosporas en lugar del micelio vegetativo (Sjöholm et al., 2013), la congelación del suelo en invierno (que generalmente no ocurre en los países más cálidos de Europa occidental) contribuye a la sincronización de la germinación y siembra de las oosporas. patata, lo que potencia su función como fuente de infección primaria (Brurberg et al., 2011). También debe tenerse en cuenta que, en las condiciones del norte, el desarrollo de la infección por oosporas sobrepasa el desarrollo de la infección tuberosa, que en última instancia previene el predominio de líneas clonales aún más agresivas, pero posteriormente desarrolladas (Yuen, 2012). La estructura de las poblaciones de P. infestans más estudiadas en Europa del Este (Polonia, Países Bálticos) es muy similar a la de Escandinavia.
Ambos tipos de apareamiento también están presentes aquí, y la gran mayoría de los genotipos determinados por el análisis de SSR son únicos (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Al igual que en el norte de Europa, la distribución de líneas clonales (principalmente del genotipo 13_A2) prácticamente no afectó a las poblaciones locales del patógeno, que retienen un alto nivel de diversidad con la ausencia de líneas dominantes pronunciadas.
La presencia de 13_A2 se observa ocasionalmente en campos con variedades comerciales de papa. En Rusia, la situación se desarrolla de manera similar. Análisis de microsatélites de aislamientos de P. infestans recolectados en 2008-2011 en 10 regiones diferentes de la parte europea de Rusia, mostró un alto grado de diversidad genotípica y una completa falta de coincidencias con las líneas clonales europeas (Statsyuk et al., 2014). Varios años después, un estudio de muestras de P. infestans recolectadas en la región de Leningrado en 2013-2014 mostró diferencias significativas entre ellos y los genotipos de esta región identificados en el estudio anterior. En ambos estudios no se encontraron genotipos de Europa occidental (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
La alta diversidad genética de las poblaciones de P. infestans de Europa del Este y la ausencia de líneas clonales dominantes en ellas puede deberse a varias razones. Primero, como en el norte de Europa, las condiciones climáticas de los países considerados contribuyen a la formación de oosporas como fuente primaria de infección (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). En segundo lugar, una proporción significativa de las papas producidas en estos países se cultivan en pequeñas granjas privadas, a menudo rodeadas de bosques u otros obstáculos al libre movimiento de material infeccioso (Chmielarz et al., 2014). Como regla general, las papas cultivadas en tales condiciones prácticamente no se tratan con productos químicos, y la elección de las variedades se basa en su resistencia al tizón tardío, es decir, no existe una presión selectiva por la agresividad y resistencia al metalaxil, lo que priva a los genotipos resistentes, como 13_A2, de ventajas sobre otros genotipos (Chmielarz et al., 2014). Finalmente, debido al pequeño tamaño de las parcelas, sus propietarios no suelen practicar la rotación de cultivos, cultivando papas en el mismo lugar durante años, lo que contribuye a la acumulación de un inóculo genéticamente diverso (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asia
Hasta hace poco, la estructura de las poblaciones de P. infestans en Asia seguía siendo relativamente poco conocida. Se sabía que está representado principalmente por líneas clonales, y el efecto de la recombinación sexual sobre la aparición de nuevos genotipos es muy pequeño. Así, por ejemplo, en 1997-1998. En la parte asiática de Rusia (Siberia y Extremo Oriente), la población de patógenos estuvo representada por sólo tres genotipos con predominio del genotipo SIB-1 (Elansky et al., 2001). Se ha demostrado la presencia de líneas de patógenos clonales en países como China, Japón, Corea, Filipinas y Taiwán (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). La línea clonal US-1, que dominó un gran territorio de Asia, a finales de los 90 y principios de los 2000. casi en todas partes comenzaron a ser reemplazados por otros genotipos, que, a su vez, dieron paso a otros nuevos. En la mayoría de los casos, los cambios en la estructura y composición de las poblaciones en los países asiáticos se asociaron con la migración de nuevos genotipos del exterior. Así, en Japón, con la excepción del genotipo JP-3, todos los demás genotipos japoneses que aparecieron después de US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) tienen un origen externo más o menos probado (Akino et al., 2011) ... En China, existen actualmente tres poblaciones principales de patógenos con una clara división geográfica; No hay flujo de genes o es muy débil entre estas poblaciones (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). El genotipo 13_A2 apareció en el territorio de China en sus provincias del sur (Yunnan y Sichuan) en 2005-2007, y en 2012-1014. también se observó en el noreste del país (Li et al., 2013b). En India, 13_A2 apareció presumiblemente al mismo tiempo que en China, muy probablemente con semillas de papa infectadas (Chowdappa et al., 2015), y en 2009-2010. causó una grave enfermedad epifitótica de tizón tardío en tomate en el sur del país, luego de lo cual se extendió a las papas y en 2014 provocó un brote de tizón tardío en Bengala Occidental, lo que provocó la ruina y el suicidio de muchos agricultores locales (Fry, 2016).
África
Hasta 2008-2010 No se han realizado estudios sistemáticos de P. infestans en países africanos. Por el momento, las poblaciones africanas de P. infestans se pueden dividir en dos grupos, y esta división está claramente asociada con el hecho de la importación de patatas de siembra de Europa.
En el norte de África, que importa activamente patatas de siembra de Europa, el tipo de apareamiento A2 está ampliamente representado en casi todas las regiones, lo que ofrece una posibilidad teórica de la aparición de nuevos genotipos como resultado de la recombinación sexual (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Además, en Argelia, se observa la presencia de los genotipos 13_A2, 2_A1 y 23_A1 con una dominancia pronunciada del primero de ellos, así como una disminución gradual en la proporción de genotipos únicos hasta su completa desaparición (Rekad et al., 2017). A diferencia del resto de la región, en Túnez (con la excepción del noreste del país), la población de patógenos está representada principalmente por el tipo de apareamiento A1 (Harbaoui et al., 2014).
La línea clonal NA-01 es dominante aquí. En general, la proporción de líneas clonales en la población es solo del 43%. En África oriental y meridional, donde el volumen de las importaciones de semillas es extremadamente pequeño (Fry et al., 2009), P. infestans está representado por solo dos líneas clonales de tipo A1, US-1 y KE-1, y la última desplaza activamente a la primera en las papas ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Hasta la fecha, ambos genotipos tienen un número notable de variaciones subclonales.
Australia
El primer informe de tizón tardío en las papas en Australia se remonta a 1907, y la primera epifitotia, probablemente causada por las fuertes lluvias en los meses de verano, ocurrió en 1909-1911. (Drenth et al., 2002). Sin embargo, en general, el tizón tardío no tiene una importancia económica significativa para el país. Los brotes esporádicos de tizón tardío, provocados por condiciones climáticas que proporcionan alta humedad, ocurren no más de una vez cada 5-7 años y se localizan principalmente en el norte de Tasmania y el centro de Victoria. En relación con lo anterior, las publicaciones dedicadas al estudio de la estructura de la población australiana de P. infestans están prácticamente ausentes. La última información disponible es de 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Según los autores, la población de Victoria fue una línea clonal US-1.3, lo que confirmó indirectamente la migración de este genotipo desde Estados Unidos. Los especímenes de Tasmania se clasificaron como AU-3, diferentes de los genotipos presentes en ese momento en otras partes del mundo.
Características del desarrollo del tizón tardío en Rusia.
En Europa, una infección introducida con tubérculos-semilla enfermos, oosporas que pasaron el invierno en el suelo, así como zoosporangios provocados por el viento de plantas cultivadas a partir de tubérculos invernados en los campos del año pasado (plantas "voluntarias"), o en montones de plantas desechadas, se consideran el inóculo principal de las patatas. marcador para el almacenamiento de tubérculos. De estas, las plantas que crecen en montones de tubérculos desechados se consideran la fuente de infección más peligrosa. allí, el número de tubérculos germinados es a menudo significativo, y los zoosporangios pueden transmitirse desde ellos a largas distancias. El resto de las fuentes (oosporas, plantas "voluntarias") no son tan peligrosas, porque no es habitual cultivar plantas en los mismos campos más de una vez cada 3-4 años. La infección por tubérculos-semilla enfermos también es mínima debido a un buen sistema de control de calidad de la semilla.
En general, la cantidad de inóculo en las poblaciones europeas es limitada y, por lo tanto, el aumento de la epidemia es bastante lento y puede controlarse con éxito utilizando preparaciones químicas fungicidas. La tarea principal en las condiciones europeas es la lucha contra la infección en la fase en la que comienza la dispersión masiva de zoosporangios de plantas infectadas.
En Rusia, la situación es radicalmente diferente. La mayor parte de la cosecha de papa y tomate se cultiva en pequeños huertos privados; las medidas de protección no se llevan a cabo en absoluto, o los tratamientos fungicidas se llevan a cabo en un número insuficiente y comienzan después de la aparición del tizón tardío en la parte superior. Como resultado, los huertos privados actúan como la principal fuente de infección, desde la cual los zoosporangios son transportados por el viento a las plantaciones comerciales. Esto es confirmado por nuestras observaciones directas en las regiones de Moscú, Bryansk, Kostroma, Ryazan: el daño a las plantas en los jardines privados se observa incluso antes del inicio de los tratamientos con fungicidas de las plantaciones comerciales. Posteriormente, la epidemia en grandes campos se frena mediante el uso de preparaciones fungicidas, mientras que en los jardines privados hay un rápido desarrollo del tizón tardío.
En el caso de tratamientos inadecuados o "presupuestarios" de las plantaciones comerciales, también aparecen focos de tizón tardío en los campos; más tarde se desarrollan activamente, cubriendo áreas cada vez más amplias (Elansky, 2015). La infección en jardines privados tiene un impacto significativo sobre las epidemias en los campos comerciales. En todas las regiones productoras de papas de Rusia, el área ocupada por papas en jardines privados es varias veces mayor que el área total de campos de grandes productores. En tal entorno, los huertos privados pueden verse como un recurso de inóculo global para campos comerciales. Intentemos identificar aquellas propiedades que son características de los genotipos de cepas en jardines privados.
La siembra sin semilla y el control cuarentenario de patatas de consumo, las semillas de tomate obtenidas de productores extranjeros dudosos, el cultivo a largo plazo de patatas y tomates en las mismas zonas, los tratamientos fungicidas inadecuados o su total ausencia provocan epifitotias graves en el sector privado, cuyo resultado es gratuito. cruzamiento, hibridación y formación de oosporas en jardines privados. Como resultado, se observa una diversidad genotípica muy alta del patógeno, cuando casi todas las cepas son únicas en su genotipo (Elansky et al., 2001, 2015). La siembra de patatas de siembra de diversos orígenes genéticos hace que sea poco probable que surjan líneas clonales especializadas para atacar una variedad en particular. Las cepas seleccionadas en tal caso se distinguen por su versatilidad en relación a las variedades afectadas, la mayoría de ellas tienen un número cercano al máximo de genes de virulencia. Esto es muy diferente del sistema de "líneas clonales" típico de grandes campos de empresas agrícolas con un sistema de protección debidamente instalado contra el tizón tardío. Las "líneas clonales" (cuando todas las cepas del patógeno del tizón tardío en el campo están representadas por uno o más genotipos) son omnipresentes en los países donde el cultivo de la papa se lleva a cabo exclusivamente en grandes fincas: los Estados Unidos, los Países Bajos, Dinamarca, etc. En Inglaterra, Irlanda, Polonia, donde las parcelas familiares también están tradicionalmente extendidas En el cultivo de papa, también hay una mayor diversidad genotípica en los jardines privados. A finales del siglo XX, las “líneas clonales” estaban muy extendidas en las partes de Asia y el Lejano Oriente de Rusia (Elansky et al., 20), lo que, aparentemente, se debe al uso de las mismas variedades para plantar exclusivamente patatas de nuestra propia producción. Recientemente, la situación en estas regiones también comenzó a cambiar hacia un aumento en la diversidad genotípica de poblaciones.
La falta de tratamientos intensivos con preparaciones fungicidas tiene otra consecuencia directa: no hay acumulación de cepas resistentes en los jardines. De hecho, nuestros resultados muestran que las cepas resistentes al metalaxilo se encuentran con mucha menos frecuencia en jardines privados que en plantaciones comerciales.
La proximidad de las plantaciones de papa y tomate, típica de los huertos privados, facilita la migración de cepas entre estos cultivos, por lo que, en la última década, entre las cepas aisladas de papa, la proporción de cepas portadoras del gen de resistencia a las variedades de tomate cherry (T1), anteriormente característico solo cepas de tomate ". Las cepas con el gen T1 en la mayoría de los casos son muy agresivas tanto con las patatas como con los tomates.
En los últimos años, el tizón tardío en el tomate comenzó a aparecer en muchos casos antes que en la papa. Las plántulas de tomate pueden estar infestadas con oosporas en el suelo, o con oosporas presentes en las semillas de tomate o adheridas a ellas (Rubin et al., 2001). En los últimos 15 años, ha aparecido en las tiendas una gran cantidad de semillas empaquetadas de bajo costo, principalmente importadas, y la mayoría de los pequeños productores han comenzado a utilizarlas. Las semillas pueden contener cepas con genotipos típicos de las regiones de su cultivo. En el futuro, estos genotipos se incluirán en el proceso sexual en jardines privados, lo que conduce a la aparición de genotipos completamente nuevos.
Así, se puede afirmar que los huertos privados son un "crisol" global, en el que, como resultado del intercambio de material genético, se procesan genotipos existentes y aparecen otros completamente nuevos. Además, su selección se realiza en condiciones muy diferentes a las creadas para la papa en las grandes fincas: ausencia de prensa fungicida, uniformidad varietal de plantaciones, predominio de plantas afectadas por diversas formas de infección viral y bacteriana, proximidad a tomates y solanáceas silvestres, cruzamiento activo y formación de oosporas, la posibilidad para que las oosporas actúen como fuente de infección durante el próximo año.
Todo esto conduce a una diversidad genotípica muy alta de poblaciones de traspatio. En las condiciones de las epifitóticas en los huertos, el tizón tardío se propaga muy rápidamente y se liberan grandes cantidades de esporas que vuelan a las plantaciones comerciales cercanas. Sin embargo, habiendo ingresado a campos comerciales con el correcto sistema de tecnología agrícola y protección química, las esporas que han llegado prácticamente no tienen oportunidad de iniciar epifitóticas en el campo, lo cual se debe a la ausencia de líneas clonales resistentes a fungicidas y especializadas a la variedad cultivada.
Otra fuente de inóculo primario pueden ser los tubérculos enfermos atrapados en plántulas comerciales. Estos tubérculos se cultivaron, por regla general, en campos con buena tecnología agrícola y protección química intensiva. Los genotipos de los aislados que infectan a los tubérculos se adaptan al desarrollo de su propia variedad. Estas cepas son significativamente más peligrosas para la siembra comercial que el inóculo procedente de jardines privados. Los resultados de nuestra investigación también apoyan esta suposición. Las poblaciones aisladas de grandes campos con protección química debidamente conducida y buena tecnología agrícola no difieren en una alta diversidad genotípica. A menudo, se trata de varias líneas clonales que son muy agresivas.
Las cepas de material de semillas comerciales pueden ingresar a las poblaciones de los huertos y participar en los procesos que se desarrollan en ellos. Sin embargo, en un huerto, su competitividad será mucho menor que en un campo comercial, y pronto dejarán de existir en forma de línea clonal, pero sus genes se pueden utilizar en la población “huerta”.
La infección que se desarrolla en plantas "voluntarias" y en montones de tubérculos desechados durante la cosecha no es tan relevante para Rusia, porque En las principales regiones productoras de papa de Rusia, se observa una congelación profunda del suelo en invierno y rara vez se desarrollan plantas de tubérculos que han pasado el invierno en el suelo. Además, como muestran nuestros experimentos, el patógeno del tizón tardío no sobrevive a temperaturas negativas incluso en tubérculos que han conservado su viabilidad. En la zona árida, donde se practica el cultivo de patatas tempranas, el tizón tardío es bastante raro debido a la estación seca y calurosa.
Por lo tanto, actualmente estamos observando la división de las poblaciones de P. infestans en poblaciones de "campo" y "jardín". Sin embargo, en los últimos años se han observado procesos que conducen a la convergencia e interpenetración de genotipos de estas poblaciones.
Entre ellos, se puede notar un aumento general en la alfabetización de los pequeños productores, la aparición de pequeños paquetes asequibles de semilla de papa, la difusión de preparados fungicidas en pequeños paquetes y la pérdida del miedo a la "química" por parte de la población.
Surgen situaciones cuando, gracias a la vigorosa actividad de un proveedor, pueblos enteros son plantados con tubérculos-semilla de la misma variedad y provistos de pequeños paquetes de los mismos plaguicidas. Se puede suponer que las papas de la misma variedad se encontrarán en plantaciones comerciales cercanas.
Por otra parte, algunas empresas comerciales de plaguicidas están promoviendo planes de tratamiento químico "presupuestarios". En este caso, se subestima el número de tratamientos recomendados y se ofrecen los fungicidas más baratos, y el énfasis no está en prevenir el desarrollo del tizón tardío hasta la siega de las puntas, sino en cierto retraso en la epifitotia para aumentar el rendimiento. Tales esquemas están económicamente justificados cuando se cultivan patatas de consumo a partir de material de siembra de baja calidad, cuando en principio no se trata de obtener un rendimiento elevado. Sin embargo, en este caso, a diferencia de las poblaciones de jardín, el fondo genético nivelado de la papa contribuye a la selección de razas fisiológicas específicas, que son muy peligrosas para esta variedad.
En general, las tendencias hacia la convergencia de los métodos de producción de papa en el "huerto" y el "campo" nos parecen bastante peligrosas. Para prevenir sus consecuencias negativas, tanto en el sector doméstico como comercial, será necesario controlar tanto el surtido de semillas de papa como la gama de fungicidas ofrecidos a los propietarios privados en pequeños envases, así como rastrear esquemas de protección de papa y el uso de fungicidas en el sector comercial.
En las áreas del sector privado, hay un desarrollo intensivo no solo del tizón tardío, sino también de Alternaria. La mayoría de los propietarios de granjas privadas no toman medidas especiales para protegerse contra Alternaria, confundiendo el desarrollo de Alternaria con el marchitamiento natural del follaje o el desarrollo del tizón tardío. Por tanto, con el desarrollo masivo de Alternaria en variedades susceptibles, las parcelas familiares pueden servir como fuente de inóculo para plantaciones comerciales.
Mecanismos de variabilidad
Proceso de mutación
Dado que la aparición de mutaciones es un proceso aleatorio que avanza con una frecuencia baja, la aparición de mutaciones en cualquier locus depende de la frecuencia de mutación de este locus y del tamaño de la población. Al estudiar la frecuencia de mutaciones de cepas de P. infestans, generalmente se determina el número de colonias que crecen en medios de nutrientes selectivos después del tratamiento con mutágenos químicos o físicos. Como puede verse en los datos presentados en la Tabla 8, la frecuencia de mutación de la misma cepa en diferentes loci puede diferir en varios órdenes de magnitud. La alta frecuencia de mutaciones en la resistencia al metalaxilo puede ser una de las razones de la acumulación de cepas resistentes a él en la naturaleza.
La frecuencia de mutaciones espontáneas o inducidas, calculada sobre la base de experimentos de laboratorio, no siempre se corresponde con los procesos que ocurren en poblaciones naturales, por las siguientes razones:
1. Con fisiones nucleares asincrónicas, es imposible estimar la frecuencia de mutaciones por generación nuclear. Por lo tanto, la mayoría de los experimentos proporcionan información solo directamente sobre la frecuencia de mutaciones, sin distinguir entre dos eventos mutacionales y un evento posterior a la mitosis.
2. Las mutaciones de un solo paso suelen reducir el equilibrio del genoma, por lo que, junto con la adquisición de una nueva propiedad, la aptitud general del organismo disminuye. La mayoría de las mutaciones obtenidas experimentalmente tienen una agresividad reducida y no se registran en poblaciones naturales. Así, el coeficiente de correlación entre el grado de resistencia de los mutantes de P. infestans a los fungicidas de fenilamida y la tasa de crecimiento en un ambiente artificial fue en promedio (-0,62), y la resistencia a los fungicidas y la agresividad en las hojas de papa (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), lo que indica la baja aptitud de los mutantes. Las mutaciones de resistencia al dimetomorfo también estuvieron acompañadas de una fuerte disminución de la viabilidad (Bagirova et al., 2001).
3. La mayoría de las mutaciones espontáneas e inducidas son recesivas y no se manifiestan fenotípicamente en experimentos, pero constituyen una reserva oculta de variabilidad en las poblaciones naturales. Las cepas mutantes aisladas en experimentos de laboratorio portan mutaciones dominantes o semi-dominantes (Kulish y Dyakov, 1979). Aparentemente, la diploidía nuclear explica los intentos fallidos de obtener mutantes bajo la influencia de la radiación ultravioleta que son virulentos en variedades previamente resistentes (McKee, 1969). Según los cálculos del autor, tales mutaciones pueden ocurrir con una frecuencia de menos de 1: 500000. La transición de mutaciones recesivas a un estado homocigótico expresado fenotípicamente puede ocurrir debido a la recombinación sexual o asexual (ver más abajo). Sin embargo, incluso en este caso, la mutación puede estar enmascarada por los alelos dominantes de los núcleos de tipo salvaje en el micelio cenótico (multinucleado) y fijarse fenotípicamente solo durante la formación de zoosporas mononucleares.
Cuadro 8. Frecuencia de mutaciones de P. infestans a sustancias inhibidoras del crecimiento bajo la acción de nitrosometilurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Conexión | Frecuencia de mutación |
Oxitetraciclina | X 6,9 10-8 |
Blasticidina S | 7,2 x 10 -8 |
Estreptomicina | 8,3 х10-8 |
Tricotecina | X 1,8 10-8 |
Cicloheximida | X 2,1 10-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimetomorfo | X 6,3 10-7 |
Metalaxil | X 6,9 10-6 |
El tamaño de la población también juega un papel decisivo en la aparición de mutaciones espontáneas. En poblaciones muy grandes, en las que el número de células N> 1 / a, donde a es la tasa de mutación, la mutación deja de ser un fenómeno aleatorio (Kvitko, 1974).
Los cálculos muestran que con una infestación promedio de un campo de papa (35 puntos por planta), se forman diariamente 8x1012 esporas en una hectárea (Dyakov y Suprun, 1984). Aparentemente, estas poblaciones contienen todas las mutaciones permitidas por el tipo de intercambio en cada locus. Incluso una mutación rara, que ocurre con una frecuencia de 10-9, será adquirida por mil individuos de los millones que viven en una hectárea de un campo de papa. Para las mutaciones que ocurren con una frecuencia más alta (por ejemplo, 10-6), en dicha población, pueden ocurrir varias mutaciones emparejadas diariamente (simultáneamente en dos loci), es decir, el proceso de mutación reemplazará a la recombinación.
Migraciones
Para P. infestans, se conocen dos tipos principales de migración: a distancias cortas (dentro de un campo de papa o campos vecinos) mediante la propagación de zoosporangios por corrientes de aire o rocío de lluvia, y a largas distancias, con la siembra de tubérculos o frutos de tomate transportados. El primer método asegura la expansión del foco de la enfermedad, el segundo, la creación de nuevos focos en lugares alejados del primario.
La propagación de la infección por tubérculos y frutos de tomate no solo contribuye a la aparición de la enfermedad en nuevos lugares, sino que también es la principal fuente de diversidad genética en las poblaciones. En la región de Moscú, se cultivan patatas, traídas de diferentes regiones de Rusia y Europa Occidental. Las frutas de tomate se traen de las regiones del sur de Rusia (región de Astrakhan, región de Krasnodar, norte del Cáucaso). Las semillas de tomate, que también pueden servir como fuentes de infección (Rubin et al., 2001), también se importan de las regiones del sur de Rusia, China, países europeos y otros países.
Según cálculos de E. Mayr (1974), los cambios genéticos en una población local causados por mutaciones rara vez superan los 10-5 por locus, mientras que en poblaciones abiertas, el intercambio debido al contraflujo de genes es de al menos 10-3-10-4.
La migración de los tubérculos infectados es responsable de la entrada de P. infestans en Europa, extendiéndose a todas las regiones del mundo donde se cultivan patatas; provocaron los cambios de población más graves. El tizón tardío de las patatas apareció en el territorio del Imperio Ruso casi simultáneamente con su aparición en Europa Occidental.
Dado que la enfermedad se observó por primera vez en 1846-1847 en los Estados bálticos y solo en los años posteriores se extendió en Bielorrusia y las regiones del noroeste de Rusia, su origen en Europa occidental es obvio. La primera fuente de tizón tardío en el Viejo Mundo no es tan obvia. La hipótesis desarrollada por Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) sugiere que el parásito vino primero de México a América del Norte, donde se propagó a través de los cultivos y luego fue transportado a Europa Occidental. (figura 7).
Como resultado de la deriva repetida (doble efecto del "cuello de botella"), llegaron a Europa clones únicos, cuya descendencia provocó una pandemia en todo el territorio del Viejo Mundo donde se cultivan las patatas. Como evidencia de esta hipótesis, los autores citan, en primer lugar, la ubicuidad de un solo tipo de apareamiento (A1) y, en segundo lugar, la homogeneidad de los genotipos de las cepas estudiadas de diferentes regiones (todas ellas basadas en marcadores moleculares, incluidos 2 loci de isoenzimas, patrones de huellas de ADN, y la estructura del ADN mitocondrial es idéntica y corresponde al clon US-1 descrito en EE. UU.). Sin embargo, algunos datos plantean dudas sobre al menos algunas de las disposiciones de la hipótesis planteada. El análisis del ADN mitocondrial de P. infestans aislado de muestras de patata de herbario infectadas durante el primer período epifitótico de la década de 40 mostró que difieren en la estructura del ADN mitocondrial del clon US-1, que, por lo tanto, era al menos no es la única fuente de infección en Europa (Ristaino et al, 2001).
La situación del tizón tardío volvió a agravarse en los años 80 del siglo XX. Se han producido los siguientes cambios:
1) La agresividad media de la población ha aumentado, lo que ha llevado, en particular, a la propagación generalizada de la forma más dañina del tizón tardío: el daño a los pecíolos y tallos.
2) Hubo un cambio en la época del tizón tardío en las papas, desde finales de julio hasta principios de julio e incluso hasta finales de junio.
3) El tipo de apareamiento A2, que anteriormente estaba ausente en el Viejo Mundo, se ha vuelto omnipresente.
Los cambios fueron precedidos por dos eventos: el uso masivo del nuevo fungicida metalaxyl (Schwinn y Staub, 1980) y el surgimiento de México como exportador mundial de papa (Niederhauser, 1993). De acuerdo con esto, se expusieron dos razones para los cambios poblacionales: conversión del tipo de apareamiento bajo la influencia del metalaxil (Ko, 1994) y la introducción masiva de nuevas cepas con tubérculos infectados de México (Fry y Goodwin, 1995). Aunque las interconversiones de los tipos de apareamiento bajo la influencia del metalaxil fueron obtenidas no solo por Ko, sino también en trabajos realizados en el laboratorio de la Universidad Estatal de Moscú (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), la segunda hipótesis es preferible. Junto con la aparición del segundo tipo de apareamiento, se produjeron cambios graves en los genotipos de las cepas rusas de P. infestans, incluidos genes neutros (loci isoenzima y RFLP), así como en la estructura del ADN mitocondrial. El complejo de estos cambios no puede explicarse por la acción del metalaxil, sino que hubo una importación masiva de nuevas cepas de México, las cuales, al ser más agresivas (Kato et al., 1997), desplazaron a las antiguas (US-1), volviéndose dominantes en las poblaciones. El cambio en la composición de las poblaciones europeas se produjo en muy poco tiempo, de 1980 a 1985 (Fry et al., 1992). En el territorio de la antigua URSS, se encontraron “nuevas cepas” en colecciones de Estonia en 1985, es decir, antes que en Polonia y Alemania (Goodwin et al., 1994). La última vez que se aisló la "vieja cepa US-1" en Rusia de un tomate infectado en la región de Moscú en 1993 (Dolgova et al., 1997). También en Francia, se encontraron cepas “antiguas” en las plantaciones de tomate hasta principios de los años 90, es decir, después de que habían desaparecido durante mucho tiempo en las patatas (Leberton y Andrivon, 1998). Los cambios en las cepas de P. infestans afectaron a muchos rasgos, incluidos los de gran importancia práctica, y aumentaron la nocividad del tizón tardío.
Recombinación sexual
Para que la recombinación sexual contribuya a la variabilidad, es necesario, en primer lugar, la presencia de dos tipos de apareamiento en la población en una proporción cercana a 1: 1 y, en segundo lugar, la presencia de la variabilidad poblacional inicial.
La proporción de tipos de apareamiento varía mucho en diferentes poblaciones e incluso en diferentes años en una población (Tabla 9,10, 90). Se desconocen las razones de cambios tan drásticos en las frecuencias de los tipos de apareamiento en las poblaciones (como, por ejemplo, en Rusia o en Israel a principios de los años 2002 del siglo pasado), pero se cree que esto se debe a la introducción de clones más competitivos (Cohen, XNUMX).
Algunos datos indirectos indican el curso del proceso sexual en ciertos años y en ciertas regiones:
1) Los estudios de poblaciones de la región de Moscú mostraron que en 13 poblaciones en las que la proporción del tipo de apareamiento A2 era inferior al 10%, la diversidad genética total calculada para tres loci de isoenzimas fue de 0,08, y en 14 poblaciones en las que la proporción de A2 excedió 30%, la diversidad genética era el doble (0,15) (Elansky et al., 1999). Por tanto, cuanto mayor es la probabilidad de tener relaciones sexuales, mayor es la diversidad genética de la población.
2) La relación entre la proporción de tipos de apareamiento en las poblaciones y la intensidad de la formación de oosporas se observó en Israel (Cohen et al., 1997) y en Holanda.
(Flier et al., 2004). Nuestros estudios mostraron que en poblaciones en las que los aislamientos con el tipo de apareamiento A2 representaron 62, 17, 9 y 6%, se encontraron oosporas en 78, 50, 30 y 15% de las hojas de papa analizadas (con 2 o más manchas), respectivamente.
Las muestras con 2 o más manchas contenían oosporas significativamente más a menudo que las muestras con 1 mancha (32 y 14% de las muestras, respectivamente) (Apryshko et al., 2004).
Las oosporas fueron mucho más comunes en las hojas de la capa media e inferior de la planta de papa (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) En algunas regiones, se han descubierto genotipos únicos, cuya aparición está asociada con la recombinación sexual. Así, en Polonia en 1989 y en Francia en 1990, las cepas homocigóticas para la glucosa-6-
fosfato isomerasa (GPI 90/90). Dado que anteriormente solo se encontraron 10/90 heterocigotos durante 100 años, la homocigosidad se atribuye a la recombinación sexual (Sujkowski et al., 1994). En Colombia (EE. UU.), Los aislamientos que combinan A2 con GPI 100/110 y A1 con GPI 100/100 son comunes, pero al final de la temporada de 1994 (16 de agosto y 9 de septiembre), las cepas con genotipos recombinantes (A1 GPI 100/110 y A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) En algunas poblaciones de Polonia (Sujkowski et al., 1994) y el norte del Cáucaso (Amatkhanova et al., 2004), la distribución de los loci de ADN de huellas dactilares y los loci de proteínas alozimáticas corresponde a la distribución de Hardy-Weinberg,
sobre la alta participación de la contribución de la recombinación sexual a la variabilidad de las poblaciones. En otras regiones de Rusia, no se encontró correspondencia con la distribución de Hardy-Weinberg en las poblaciones, pero se mostró la presencia de desequilibrio de ligamiento, lo que indica el predominio de la reproducción clonal (Elansky et al., 1999).
5) La diversidad genética (GST) entre cepas con diferentes tipos de apareamiento (A1 y A2) fue menor que entre diferentes poblaciones (Sujkowski et al., 1994), lo que indirectamente indica cruces sexuales.
Al mismo tiempo, la contribución de la recombinación sexual a la diversidad de la población no puede ser muy alta. Esta contribución se calculó para las poblaciones de la región de Moscú (Elansky et al., 1999). Según los cálculos de Lewontin (1979) “la recombinación, que puede producir nuevas variantes a partir de dos loci con una frecuencia que no exceda el producto de sus heterocigosidades, se vuelve efectiva solo si los valores de heterocigosidad para ambos alelos ya son altos”.
Con la relación de los dos tipos de emparejamiento, que es típico de la región de Moscú, igual a 4: 1, la frecuencia de recombinación será de 0,25. La probabilidad de que las cepas cruzadas sean heterocigóticas para dos de los tres loci isozigóticos estudiados en las poblaciones estudiadas fue de 0,01 (2 cepas de 177). En consecuencia, la probabilidad de aparición de heterocigotos dobles como resultado de la recombinación no debe exceder su producto multiplicado por la probabilidad de cruce (0,25x0,02x0,02) = 10-4, es decir Los recombinantes sexuales no suelen formar parte de la muestra de cepas estudiada. Estos cálculos se realizaron para poblaciones de la región de Moscú, que se caracterizan por una variabilidad relativamente alta. En poblaciones monomórficas como las siberianas, el proceso sexual, incluso si ocurre en poblaciones separadas, no puede influir en su diversidad genética.
Además, P. infestans se caracteriza por una desalineación cromosómica frecuente en la meiosis, que conduce a la aneuploidía (Carter et al., 1999). Tales violaciones reducen la fertilidad de los híbridos.
Recombinación parasexual, conversión de genes mitóticos
En experimentos sobre el empalme de cepas de P. infestans con mutaciones en la resistencia a diferentes inhibidores del crecimiento, se encontró la aparición de misolatos resistentes a ambos inhibidores (Shattock y Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Las cepas resistentes a dos inhibidores del crecimiento surgieron como resultado de la heterocariotización del micelio, y en este caso se escindieron durante la reproducción por zoosporas mononucleares (Judelson, Ge Yang, 1998), o no se escindieron en descendencia monozoosporosa, porque tenían núcleos tetraploides (ya que los aislados iniciales son diploides) (K , 1979). Diploides heterocigotos segregados con una frecuencia muy baja debido a haploidización, no disyunción cromosómica y cruzamiento mitótico (Poedinok et al., 1982). La frecuencia de estos procesos podría incrementarse con la ayuda de ciertas acciones sobre diploides heterocigotos (por ejemplo, irradiación UV de esporas en germinación).
Aunque la formación de híbridos vegetativos con doble resistencia ocurre no solo in vitro, sino también en tubérculos de papa infectados con una mezcla de mutantes (Kulish et al., 1978), es bastante difícil evaluar el papel de la recombinación parasexual en la generación de nuevos genotipos en poblaciones. La frecuencia de formación de segregantes debido a haploidización, no disyunción de cromosomas y cruzamiento mitótico sin efectos especiales es insignificante (menos de 10-3).
La aparición de segregantes homocigotos de cepas heterocigotas puede basarse tanto en el cruce mitótico como en la conversión del gen mitótico, que en P. sojae ocurre con una frecuencia de 3 x 10-2 a 5 x 10-5 por locus, dependiendo de la cepa (Chamnanpunt et al. , 2001).
Aunque la frecuencia de aparición de heterocariones y diploides heterocigotos resultó ser inesperadamente alta (alcanzando decenas de por ciento), este proceso ocurre solo cuando se empalman cultivos mutantes obtenidos de la misma cepa. Cuando se utilizan diferentes cepas aisladas de la naturaleza, la heterocariotización no ocurre (o ocurre con una frecuencia muy baja) debido a la presencia de incompatibilidad vegetativa (Poedinok y Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). En consecuencia, el papel de la recombinación parasexual puede reducirse solo a la recombinación intraclonal en núcleos heterocigotos y la transición de genes individuales a un estado homocigoto sin un proceso sexual. Este proceso puede tener importancia epidemiológica en cepas con mutaciones recesivas o semidominantes de resistencia a fungicidas. Su transición a un estado homocigoto debido al proceso parasexual aumentará la resistencia del portador de la mutación (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresión de genes
Las especies heterotálicas Phytophthora son capaces de cruzarse con la formación de oosporas híbridas (ver Vorob'eva y Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). El híbrido natural de las dos especies de Phytophthora fue tan agresivo que mató a miles de alisos en el Reino Unido (Brasier et al., 1999). P. infestans puede ocurrir con otras especies del género (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, etc.) en plantas hospedantes comunes y en el suelo, pero hay poca información en la literatura sobre la posibilidad de híbridos interespecíficos. En condiciones de laboratorio, se obtuvieron híbridos entre P. infestans y P. Mirabilis (Goodwin y Fry, 1994).
Tabla 9. La proporción de cepas de P. infestans con tipo de apareamiento A2 en diferentes países del mundo en el período de 1990 a 2000 (según los datos de fuentes y sitios de literatura abierta www.euroblight.net, www.eucablight.org)
país | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
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Belarús | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Bélgica | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonia | 8 (12) | ||||||||||
Inglaterra | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlandia | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francia | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Hungría | 72 (32) | ||||||||||
Irlanda | 4 (145) | ||||||||||
Norte. Irlanda | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Países Bajos | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Noruega | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Perú | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polonia | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Escocia | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Suecia | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Gales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Corea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
China | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marruecos | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Serbia | 76 (37) | ||||||||||
México (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Cuadro 10. La proporción de cepas de P. infestans con tipo de apareamiento A2 en diferentes países del mundo en el período de 2000 a 2011
país | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austria | 65 (83) | ||||||||||
Belarús | 42 (78) | ||||||||||
Bélgica | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Suiza | 89 (19) | ||||||||||
República Checa | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Alemania | 95 (53) | ||||||||||
Dinamarca | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonia | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Inglaterra | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlandia | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francia | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Hungría | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Norte. Irlanda | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Países Bajos | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Noruega | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Perú | 0 (36) | ||||||||||
Polonia | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Escocia | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Suecia | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Eslovaquia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Gales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Corea | 46 (26) | ||||||||||
Brasil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
China | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinámica de la composición genotípica de poblaciones.
Los cambios en la composición genotípica de las poblaciones de P. infestans pueden ocurrir bajo la influencia de la migración de nuevos clones de otras regiones, prácticas agrícolas (cambio de variedades, aplicación de fungicidas) y condiciones climáticas. Las influencias externas afectan de manera diferente a los clones en diferentes etapas del ciclo de vida; por lo tanto, las poblaciones experimentan anualmente cambios cíclicos en las frecuencias de los genes sujetos a selección, debido a un cambio en el papel predominante de la deriva y selección de genes.
Influencia de la variedad
Los nuevos cultivares con genes eficaces para la resistencia vertical (genes R) son un poderoso factor selectivo que selecciona clones con genes de virulencia complementarios en poblaciones de P. infestans. En ausencia de resistencia inespecífica en la variedad de papa que inhiba el crecimiento de la población de patógenos, el proceso de reemplazo de los clones dominantes en la población ocurre muy rápidamente. Entonces, después de la propagación en la región de Moscú de la variedad Domodedovsky, que tiene el gen de resistencia R3, la frecuencia de clones virulentos para esta variedad aumentó de 0,2 a 0,82 en un año (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Sin embargo, el cambio en las frecuencias de los genes de virulencia (patotipos) en las poblaciones ocurre no solo bajo la influencia de las variedades de papa cultivadas. Por ejemplo, en Bielorrusia hasta 1977 dominaron los clones con los genes de virulencia 1 y 4, lo cual fue causado por el cultivo de variedades de papa con genes de resistencia R1 y R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Sin embargo, a finales de la década de los 70 del siglo XX aparecieron clones con diferentes genes de virulencia y sus combinaciones, y los genes de resistencia complementarios nunca se utilizaron en el mejoramiento de la papa (genes de virulencia extra) (Ivanyuk et al., 2002). La razón de la aparición de tales clones, aparentemente, se debe a la migración a Europa de material infeccioso de México con tubérculos de papa. En casa, estos clones se desarrollaron no solo en papas cultivadas, sino también en especies silvestres portadoras de una variedad de genes de resistencia; por lo tanto, la combinación de muchos genes de virulencia en el genoma era necesaria para sobrevivir en esas condiciones.
En cuanto a las variedades con resistencias inespecíficas, al reducir la tasa de reproducción del patógeno, retrasan la evolución de sus poblaciones, que, como ya se mencionó, es función del número. Dado que la agresividad es poligénica, los clones que contienen un mayor número de genes de "agresividad" se acumulan cuanto antes cuanto mayor sea el tamaño de la población. Por tanto, las razas altamente agresivas no son producto de la adaptación a variedades cultivadas con resistencias inespecíficas, sino que, por el contrario, es más probable que se detecten en las plantaciones de variedades altamente susceptibles que son acumuladoras de las esporas del parásito.
Así, en Rusia, las poblaciones más agresivas de P. infestans se encontraron en zonas de epifitotias anuales (poblaciones de las regiones de Sakhalin, Leningrado y Bryansk). La agresividad de estas poblaciones resultó ser mayor que la mexicana (Filippov et al., 2004).
Además, se forman menos oosporas en las hojas de las variedades resistentes que en las susceptibles (Hanson y Shattock, 1998), es decir, la resistencia inespecífica de la variedad también reduce la capacidad de recombinación del parásito y la posibilidad de métodos alternativos de invernada.
Influencia de los fungicidas
Los fungicidas no solo reducen el número de hongos fitopatógenos, es decir, afectan las características cuantitativas de sus poblaciones, pero también pueden cambiar las frecuencias de genotipos individuales, es decir, influir en la composición cualitativa de las poblaciones. Entre los indicadores más importantes de poblaciones que cambian bajo la influencia de fungicidas se encuentran los siguientes: cambios en la resistencia a los fungicidas, cambios en la agresividad y virulencia y cambios en los sistemas reproductivos.
Influencia de los fungicidas en la resistencia y agresividad de las poblaciones
El grado de esta influencia está determinado, en primer lugar, por el tipo de fungicida utilizado, que se puede dividir condicionalmente en polisita, oligosita y monosita.
El primero incluye la mayoría de los fungicidas de contacto. La resistencia a ellos (si es que es posible) está controlada por un gran número de genes de expresión muy débil. Estas propiedades determinan la ausencia de cambios visibles en la resistencia de la población después del tratamiento con fungicidas (aunque en algunos experimentos se obtuvo cierto aumento de la resistencia). La población de hongos que se conserva después de la pulverización con fungicidas de contacto consta de dos grupos de cepas:
1) Cepas conservadas en áreas de plantas no tratadas con el fármaco. Dado que no hubo contacto con el fungicida, la agresividad y resistencia de estas cepas no cambia.
2) Cepas en contacto con el fungicida, cuya concentración en los puntos de contacto fue menor que letal. Como se mencionó anteriormente, la resistencia de esta parte de la población tampoco cambia, sin embargo, debido al efecto dañino parcial del fungicida incluso en concentración subletal sobre el metabolismo de la célula fúngica, la aptitud general y su componente parasitario, la agresividad, disminuyen (Derevyagina y Dyakov, 1990).
Así, incluso una parte de la población que no ha muerto, expuesta al contacto con el fungicida, tiene una agresividad débil y no puede ser fuente de epifitóticos. Por lo tanto, un procesamiento cuidadoso, que reduce la frecuencia de la proporción de la población que no está en contacto con el fungicida, es una condición para el éxito de las medidas de protección. La resistencia a los fungicidas de oligosita está controlada por varios genes aditivos.
La mutación de cada gen conduce a cierto aumento de la resistencia, y el grado general de resistencia se debe a la adición de tales mutaciones. Por tanto, el aumento de la resistencia se produce de forma escalonada. Un ejemplo de un aumento gradual de la resistencia son las mutaciones en la resistencia al fungicida dimetomorfo, que se usa ampliamente para proteger las papas del tizón tardío. La resistencia al dimetomorfo es poligénica y aditiva. Una mutación de un paso aumenta ligeramente la resistencia.
Cada mutación posterior disminuye el tamaño del objetivo y, en consecuencia, la frecuencia de mutaciones posteriores (Bagirova et al., 2001). El aumento de la resistencia media de la población tras tratamientos repetidos con fungicida oligosita se produce de forma escalonada y gradual. La velocidad de este proceso está determinada por al menos tres factores: la frecuencia de mutación de los genes de resistencia, el coeficiente de resistencia (la proporción de la dosis letal de una cepa resistente en relación con una sensible) y el efecto de las mutaciones en los genes de resistencia sobre la aptitud.
La frecuencia de ocurrencia de cada mutación subsiguiente es menor que la anterior, por lo que el proceso tiene un carácter amortiguador (Bagirova et al., 2001). Sin embargo, si ocurren procesos de recombinación (sexual o parasexual) en la población, entonces es posible combinar diferentes mutaciones de los padres en una cepa híbrida y acelerar el proceso. Por lo tanto, las poblaciones de panmix adquieren resistencia más rápidamente que las poblaciones agámicas y, en estas últimas, las poblaciones que no tienen barreras de incompatibilidad vegetativa más rápidamente que las poblaciones separadas por tales barreras. En este sentido, la presencia de cepas en poblaciones que difieren en los tipos de apareamiento acelera el proceso de adquisición de resistencia a los fungicidas oligositos.
El segundo y tercer factores no contribuyen a la rápida acumulación de cepas resistentes al dimetomorfo en las poblaciones. Cada mutación subsiguiente duplica aproximadamente la resistencia, que es insignificante, y al mismo tiempo reduce tanto la tasa de crecimiento en un ambiente artificial como la agresividad (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Quizás es por eso que prácticamente no hay cepas resistentes entre las cepas naturales de P. infestans, incluso las recolectadas de plantaciones de papa tratadas con dimetomorf.
Una población tratada con un fungicida oligosita también estará formada por dos grupos de cepas: aquellas que no han estado en contacto con el fungicida, y por tanto no han cambiado los rasgos iniciales (si se encuentran cepas resistentes en este grupo, no se acumularán debido a la mayor agresividad y competitividad de las cepas sensibles), y cepas en contacto con concentraciones subletales del fungicida. Es entre estos últimos donde es posible la acumulación de cepas resistentes, porque aquí tienen ventajas sobre las sensibles.
Por lo tanto, cuando se utilizan fungicidas oligositos, lo importante no es tanto un tratamiento completo como una concentración alta del fármaco, varias veces superior a la dosis letal, porque con la mutagénesis escalonada, la resistencia inicial de las cepas mutadas es baja.
Finalmente, las mutaciones en la resistencia a fungicidas monositios son altamente expresivas, es decir, una sola mutación puede reportar un alto nivel de resistencia hasta la pérdida completa de sensibilidad. Por tanto, el aumento de la resistencia de las poblaciones se produce muy rápidamente.
Un ejemplo de tales fungicidas son las fenilamidas, incluido el fungicida más común, metalaxil. Las mutaciones de resistencia surgen con una alta frecuencia, y el grado de resistencia en los mutantes es muy alto: excede la cepa sensible en un factor de mil o más (Derevyagina et al., 1993). Aunque la tasa de crecimiento y la agresividad de los mutantes resistentes disminuye en el contexto de la muerte de cepas susceptibles a un fungicida sistémico, el número de la población resistente está creciendo rápidamente y, en paralelo, su agresividad está aumentando. Por lo tanto, después de varios años de uso del fungicida, la agresividad de las cepas resistentes no solo puede igualar la agresividad de las sensibles, sino también superarla (Derevyagina y Dyakov, 1992).
Efecto sobre la recombinación sexual
Dado que la frecuente aparición del tipo de apareamiento A2 en las poblaciones de P. infestans coincidió con el uso intensivo de metalaxyl contra el tizón tardío, se sugirió que el metalaxyl induce la conversión del tipo de apareamiento. En P. parasitica, tal conversión bajo la acción de cloroneb y metalaxil fue probada experimentalmente (Ko, 1994). Un solo pase en un medio con una concentración baja de metalaxilo condujo a la aparición de aislados homotálicos de una cepa de P. infestans sensible al metalaxilo con apareamiento tipo A1 (Savenkova y Cherepnikova-Anikina, 2002). Durante los pases posteriores en medios con una concentración más alta de metalaxilo, no se detectó ni un solo aislamiento del tipo de emparejamiento A2; sin embargo, la mayoría de los aislados, cuando se cruzaron con los aislados A2, en lugar de oosporas, formaron acumulaciones de micelio desagradables y fueron estériles. Los pasajes de una cepa resistente que tiene el tipo de apareamiento A2 en medios con una alta concentración de metalaxilo nos permitió detectar tres formas de cambios en el tipo de apareamiento: 1) esterilidad completa cuando se cruza con aislamientos A1 y A2; 2) homotalismo (la formación de oosporas en un monocultivo); 3) conversión del tipo de apareamiento A2 en A1. Así, el metalaxil puede provocar cambios en los tipos de apareamiento en las poblaciones de P. infestans y, en consecuencia, la aparición de recombinación sexual en ellas.
Efectos sobre la recombinación vegetativa
Algunos genes de resistencia a antibióticos aumentaron la frecuencia de heterocariotización de hifas y diploidización nuclear (Poedinok y Dyakov, 1981). Como se señaló anteriormente, la heterocariotización de las hifas durante la fusión de diferentes cepas de P. infestans ocurre muy raramente debido al fenómeno de incompatibilidad vegetativa en este hongo. Sin embargo, los genes de resistencia a algunos antibióticos pueden tener efectos secundarios, que se expresan en la superación de la incompatibilidad vegetativa. Esta propiedad la poseía el gen de resistencia a la estreptomicina del mutante 1S-1. La presencia de tales mutantes en las poblaciones de campo de phytophthora puede aumentar el flujo de genes entre cepas y acelerar la adaptación de toda la población a nuevas variedades o fungicidas.
Ciertos fungicidas y antibióticos pueden influir en la frecuencia de la recombinación mitótica, lo que también puede alterar la frecuencia de los genotipos en las poblaciones. El fungicida benomyl, ampliamente utilizado, se une a la beta-tubulina, una proteína a partir de la cual se construyen los microtúbulos del citoesqueleto y, por lo tanto, interrumpe los procesos de separación de cromosomas en la anafase de la mitosis, aumentando la frecuencia de recombinación mitótica (Hastie, 1970).
El fungicida parafluorofenilalanina, que se usa para tratar la enfermedad holandesa en los olmos, tiene la misma propiedad. La para-fluorofenilalanina aumentó la frecuencia de recombinación en diploides heterocigotos P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cambios cíclicos en la composición genotípica de poblaciones en el ciclo de vida de P. infestans
El ciclo de desarrollo clásico de P. infestans en la zona templada consta de 4 fases.
1) Fase de crecimiento exponencial de la población (fase policíclica) con generaciones cortas. Esta fase suele comenzar en julio y dura entre 1,5 y 2 meses.
2) La fase de detener el crecimiento de la población debido a una fuerte disminución en la proporción de tejido no afectado o la aparición de condiciones climáticas desfavorables. Esta fase en las explotaciones que llevan a cabo la eliminación temprana de hojas antes de la cosecha cae fuera del ciclo anual.
3) La fase de invernada de los tubérculos, acompañada de una disminución significativa del tamaño de la población debido a la infección accidental de los tubérculos, el lento desarrollo de la infección en ellos, la ausencia de reinfección de los tubérculos, la pudrición y el sacrificio de los tubérculos afectados en condiciones normales de almacenamiento.
4) La fase de desarrollo lento en suelo y en plántulas (fase monocíclica), en la que la duración de la generación puede alcanzar un mes o más (finales de mayo - principios de julio). Por lo general, en este momento, las hojas enfermas son difíciles de detectar, incluso con observaciones especiales.
Fase de crecimiento poblacional exponencial (fase policíclica)
Numerosas observaciones (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) mostraron que al comienzo de la epifitotía predominan los clones poco virulentos y ligeramente agresivos, que posteriormente son reemplazados por otros más virulentos y agresivos. la tasa de crecimiento de la agresividad de la población es mayor, menos resistente es la variedad de la planta hospedante.
A medida que crece la población, aumenta la concentración de genes selectivamente importantes introducidos en variedades comerciales (R1-R4) y selectivamente neutros (R5-R11). Entonces, en las poblaciones cercanas a Moscú en 1993, la virulencia promedio desde finales de julio hasta mediados de agosto aumentó de 8,2 a 9,4, y el mayor aumento se observó para el gen de virulencia selectivamente neutral R5 (del 31 al 86% de los clones virulentos) (Smirnov, 1996 ).
Una disminución en la tasa de crecimiento de una población va acompañada de una disminución en la actividad parasitaria de la población. Por tanto, en años depresivos, tanto el número total de razas como la proporción de razas muy virulentas son menores que en los epifitóticos (Borisenok, 1969). Si en el apogeo de las condiciones climáticas epifitóticas cambian a desfavorables para el tizón tardío y la infestación de papa disminuye, la concentración de clones altamente virulentos y agresivos también disminuye (Rybakova et al., 1987).
El aumento en las frecuencias de genes que afectan la virulencia y agresividad de la población puede deberse a la selección de clones más virulentos y agresivos en la población mixta. Para demostrar la selección, se desarrolló un método para el análisis de mutaciones neutrales, que se utilizó con éxito en poblaciones de levadura quimiostaticas (Adams et al., 1985) y Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
La frecuencia de mutantes resistentes a blasticidina S en la población de campo de P. infestans disminuyó en paralelo con el crecimiento de la agresividad de la población, lo que indica un cambio en los clones dominantes en el proceso de crecimiento poblacional (Rybakova et al., 1987).
Fase de invernada en tubérculos
Durante la invernada en los tubérculos de papa, la virulencia y agresividad de las cepas de P. infestans disminuyen, y la disminución de la virulencia ocurre más lentamente que la agresividad (Rybakova y Dyakov, 1990). Aparentemente, en condiciones propicias para el rápido crecimiento del tamaño de la población (selección r), los genes de virulencia "extra" y alta agresividad son útiles, por lo que el desarrollo de epifitóticos se acompaña de la selección de los clones más virulentos y agresivos. En condiciones de saturación del medio, cuando no la tasa de reproducción, pero la persistencia de la existencia en condiciones desfavorables (selección K) juega un papel importante, los genes "extra" de virulencia y agresividad reducen la aptitud, y los clones con estos genes son los primeros en morir, por lo que la agresividad y la agresividad promedio la virulencia de la población está disminuyendo.
Fase de vegetación en suelo
Esta fase es la más misteriosa del ciclo de vida (Andrivon, 1995). Su existencia se postula de forma puramente especulativa, debido a la falta de información sobre lo que le sucede al patógeno durante un largo período (a veces más de un mes), desde la aparición de las plántulas de papa hasta la aparición de las primeras manchas de la enfermedad en ellas. Sobre la base de observaciones y experimentos, se reconstruyó el comportamiento del hongo en este período de la vida (Hirst y Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
La esporulación del hongo se puede formar en los tubérculos infectados del suelo. Las esporas resultantes germinan con hifas, que pueden vegetar durante mucho tiempo en el suelo. Las esporas primarias (formadas en tubérculos) y secundarias (en el micelio del suelo) ascienden a la superficie del suelo por corrientes capilares, pero adquieren la capacidad de infectar las patatas sólo después de que sus hojas inferiores descienden y entran en contacto con la superficie del suelo. Tales hojas (es decir, las primeras manchas de la enfermedad se encuentran en ellas) no se forman de inmediato, sino después de un crecimiento y desarrollo prolongados de las puntas de las papas.
Así, la fase de vegetación saprotrófica también puede existir en el ciclo de vida de P. infestans. Si en la fase parasitaria del ciclo de vida la agresividad es el componente más importante de la aptitud, entonces en la fase saprotrófica la selección tiene como objetivo reducir las propiedades parasitarias, como se ha demostrado experimentalmente para algunos hongos fitopatógenos (ver Carson, 1993). Por lo tanto, en esta fase del ciclo, las propiedades agresivas deben perderse de manera más intensa. Pero hasta ahora no se han realizado experimentos directos para confirmar las suposiciones anteriores.
Los cambios estacionales afectan no solo las propiedades patógenas de P. infestans, sino también la resistencia a los fungicidas, que crece en la fase policíclica (durante las epifitotias) y disminuye durante el almacenamiento invernal (Derevyagina et al., 1991; Kadish y Cohen, 1992). Se observó una caída particularmente intensa de la resistencia al metalaxil en el período entre la siembra de los tubérculos afectados y la aparición de las primeras manchas de la enfermedad en el campo.
La especialización intraespecífica y su evolución
P. infestans está causando epidemias en dos cultivos de importancia comercial, la papa y el tomate. Las epifitotias en las papas comenzaron poco después de que el hongo ingresara en nuevas áreas. La derrota del tomate también se notó poco después de la aparición de la infección en las papas, pero las epífitas en el tomate se notaron solo cien años después, a mediados del siglo XX. Esto es lo que escriben Hallegli y Niederhauser sobre la derrota de los tomates en EE. UU.
(1962): “Durante unos 100 años después del severo período epifitótico de 1845, se hicieron pocos o casi ningún intento para obtener variedades de tomate resistentes. Aunque el tizón tardío se registró por primera vez en los tomates ya en 1848, no se convirtió en objeto de atención seria por parte de los fitomejoradores de esta planta hasta un fuerte brote de la enfermedad en 1946. En el territorio de Rusia, el tizón tardío del tomate se registró en el siglo XIX. “Durante mucho tiempo, los investigadores no prestaron atención a esta enfermedad, ya que no causaba daños económicos significativos. Pero en los años 60 y 70. Se observan epifitotias del tizón tardío en tomate del siglo XX en la Unión Soviética, principalmente en la región del Bajo Volga, Ucrania, el norte del Cáucaso, Moldavia ... ”(Balashova, 1979).
Desde entonces, el tizón del tomate por tizón tardío se ha convertido en anual, se extiende por todo el territorio del cultivo industrial y doméstico y causa un enorme daño económico a este cultivo. ¿Que pasó? ¿Por qué la primera aparición del parásito en la papa y la lesión epifitótica de este cultivo ocurrieron casi simultáneamente, mientras que tardó un siglo en aparecer la epifitótica en el tomate? Estas diferencias están a favor de una fuente de infección mexicana en lugar de sudamericana. Si la especie Phytophthora infestans se formó como parásito de especies mexicanas portadoras de tubérculos del género Solanum, entonces es comprensible por qué la papa cultivada perteneciente a la misma sección del género que la especie mexicana se vio tan fuertemente afectada, pero debido a la ausencia de coevolución con el parásito, que no desarrolló mecanismos de resistencia específicos e inespecíficos.
El tomate pertenece a una sección diferente del género, el tipo de su intercambio tiene diferencias significativas con las especies tuberosas, por lo tanto, a pesar de que el tomate no está fuera de la especialización alimentaria de P. infestans, la intensidad de su derrota fue insuficiente para graves pérdidas económicas.
La aparición de epifitotias en tomate se debe a serios cambios genéticos en el parásito, que aumentaron su adaptabilidad (patogenicidad) cuando fue parasitado. Creemos que la nueva forma especializada para parasitar el tomate es la raza T1 descrita por M. Gallegly, que afecta a variedades de tomate cherry (Red Cherry, Ottawa), resistentes a la raza T0 generalizada en las patatas (Gallegly, 1952). Al parecer, una mutación (o una serie de mutaciones) que convirtió la raza T0 en la raza T1 y propició la aparición de clones muy adaptados a la derrota del tomate. Como sucede a menudo, un aumento de la patogenicidad en un huésped fue acompañado por su disminución en otro, es decir, surgió una especialización intraespecífica inicial, aún no completa, a las papas (raza T0) y al tomate (raza T1).
¿Cuál es la evidencia de esta suposición?
- Ocurrencia en patatas y tomates. En las hojas de tomate predomina la raza T1, mientras que en las hojas de patata es poco común. Según S.F.Bagirova y T.A. Oreshonkova (no publicado) en la región de Moscú en 1991-1992, la ocurrencia de la raza T1 en las plantaciones de papa fue del 0% y en las plantaciones de tomate del 100%; en 1993-1995: 33% y 90%, respectivamente; en 2001 - 0% y 67%. Se obtuvieron datos similares en Israel (Cohen, 2002). Los experimentos con la infección de tubérculos de papa con aislados de la raza T1 y una mezcla de los aislados T0 y T1 mostraron que los aislados de la raza T1 están mal conservados en los tubérculos y son reemplazados por aislados de la raza T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinámica de la raza T1 en plantaciones de tomate. La infección primaria de las hojas de tomate se realiza mediante aislamientos de la raza T0, que dominan en el análisis de la infección en las primeras manchas formadas en las hojas. Esto confirma el esquema generalmente aceptado de la migración del parásito: la principal masa de infección de la papa está constituida por la raza T0, sin embargo, un pequeño número de clones T1 conservados en las papas, una vez en el tomate, desplazan la raza T0 y se acumulan hacia el final del período epifitótico. También es posible que exista una fuente alternativa de infección de las hojas de tomate con la raza T1, no tan potente como los tubérculos y las hojas de papa, pero constante. Por tanto, esta fuente tiene un efecto débil sobre la estructura genética de la población que infecta el tomate, pero posteriormente determina la acumulación de la raza T1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agresividad a patatas y tomates. La infección artificial de hojas de tomate y papa con aislamientos de las razas T0 y T1 mostró que las primeras son más agresivas para la papa que para el tomate, y las segundas son más agresivas para el tomate que para la papa. Estas diferencias se manifiestan en el desplazamiento de aislamientos de una raza no "propia" de una población mixta durante los pases sobre hojas en un invernadero (Dyakov et al., 1975) y en parcelas de campo (Leberton et al., 1999); diferencias en la carga infecciosa mínima, el período de latencia, el tamaño de los puntos infecciosos y la producción de esporas (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al., 1999; al., 2000; Vega-Sanchez et al., 2002; Knapova, Gisi, 2004; Sussuna et al., XNUMX).
La agresividad de los aislados de la raza T1 hacia los cultivares de tomate que carecen de genes de resistencia es tan alta que estos aislados se esporan en las hojas como en un medio nutritivo sin necrosar el tejido infectado (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulencia para patatas y tomates. La raza T1 afecta a las variedades de tomate cherry con el gen de resistencia Ph1, mientras que la raza T0 no es capaz de infectar estas variedades, es decir. tiene una virulencia más estrecha. En relación a los diferenciadores
Los genes R de las patatas están inversamente relacionados, es decir, las cepas aisladas de hojas de tomate son menos virulentas que las cepas de “papa” (Cuadro 11).
5) Marcadores neutrales. El análisis de marcadores neutrales en las poblaciones de P. infestans que parasitan en patatas y tomates también atestigua la selección intraespecífica multidireccional. En las poblaciones brasileñas de P. infestans, los aislados de hojas de tomate pertenecían a la línea clonal US-1 y los de hojas de papa pertenecían a la línea BR-1 (Suassuna et al., 2004). En Florida (EE. UU.), Desde 1994, el clon US-90 comenzó a dominar la papa (con una ocurrencia de más del 8%), y los clones US-11 y US-17 en tomate, y los aislados de este último son más agresivos para el tomate que para la papa (Weingartner , Tombolato, 2004). Se establecieron diferencias significativas en las frecuencias de genotipos (huellas de ADN) en aislados de papa y tomate para 1200 cepas de P. infestans recolectadas en los Estados Unidos entre 1989 y 1995 (Deahl et al., 1995).
El uso del método AFLP permitió separar 74 cepas recolectadas de hojas de papa y tomate en 1996-1997. en Francia y Suiza, en 7 grupos. Las cepas de papa y tomate no diferían claramente, pero las cepas de "papa" eran genéticamente más diversas que las de "tomate". Los primeros se encontraron en los siete grupos, y los segundos, solo en cuatro, lo que indica un genoma más especializado de los últimos (Knapova y Gisi, 2002).
6) Mecanismos de aislamiento. Si las poblaciones del parásito en dos especies de plantas hospedadoras evolucionan hacia un estrechamiento de la especialización a su hospedador "propio", entonces surgen varios mecanismos premeióticos y posmeióticos que evitan los intercambios genéticos entre poblaciones (Dyakov y Lekomtseva, 1984).
Varios estudios han investigado el efecto de la fuente de las cepas parentales sobre la eficiencia de la hibridación. Al cruzar cepas aisladas de diferentes especies del género Solanum en Ecuador (Oliva et al., 2002), se encontró que las cepas con apareamiento tipo A2 de solanáceas silvestres (línea clonal EC-2) son las peores cruzadas con cepas de tomate (línea EC -3), y se cruzó más eficazmente con la cepa de patata (EC-1).
Se encontró que todos los híbridos no eran patógenos. Los autores creen que el bajo porcentaje de hibridación y la reducción de patogenicidad en híbridos se deben a mecanismos posmeióticos de aislamiento reproductivo de poblaciones.
En los experimentos de Bagirova et al. (1998), se cruzaron un gran número de cepas de papa y tomate con las propiedades de las razas T0 y T1. Los más fértiles fueron los cruces de cepas T1xT1 aisladas de tomate (36 oosporas en el campo de visión del microscopio, 44% de germinación de oosporas), los menos efectivos fueron los cruces de razas T0xT1 aisladas de diferentes hospedadores (un número bajo de oosporas en desarrollo y germinadas, una alta proporción de oosporas abortivas y subdesarrolladas) ... La eficiencia de los cruces entre aislados de la raza T0 aislados de patatas fue intermedia. Dado que el cuerpo principal de las cepas de la raza T0 afecta a las patatas, tiene una fuente fiable de invernada: los tubérculos de patata, por lo que la importancia de las oosporas como unidades infecciosas invernales para las poblaciones de patatas es baja. La "forma de tomate" adaptada puede invernar en el tomate en forma de oosporas (ver más abajo) y por lo tanto conserva una mayor productividad del proceso sexual. Debido a su alta fertilidad, T1 adquiere un potencial independiente de infección primaria en tomate. Los resultados obtenidos por Knapova et al. (Knapova et al., 2002) se pueden interpretar de la misma manera. Los cruces de cepas aisladas de patatas con cepas de tomate dieron el mayor número de oosporas: 13,8 por mm5. medio (con una propagación de 19-6,3) y un porcentaje intermedio de germinación de oosporas (0 con una propagación de 24-7,6). Los cruces de cepas aisladas de tomate arrojaron el menor porcentaje de oosporas (4 con una extensión de 12-10,8) con el mayor porcentaje de su germinación (8,6). Los cruces entre las cepas aisladas de patatas dieron un número intermedio de oosporas (0 con una alta dispersión de datos - 30-2,7) y el menor porcentaje de germinación de oosporas (90). Por tanto, las cepas de patatas son menos fértiles que las de tomate, pero los cruces interpoblacionales no dieron peores resultados que los intrapoblacionales. Es posible que las diferencias con los datos anteriores de Bagirova et al. se explican por el hecho de que los investigadores rusos trabajaron con cepas aisladas a principios de los años 90 del siglo XX, y los investigadores suizos, con cepas aisladas a finales de los XNUMX.
La base de la baja fertilidad puede ser la heteroploidía de las cepas. Si en poblaciones mexicanas, donde el proceso sexual y la infección primaria con progenie de oosporas son regulares, la mayoría de las cepas estudiadas de P. infestans son diploides, entonces en los países del Viejo Mundo se observa polimorfismo intrapoblacional de ploidía (cepas di-, tri- y tetraploides, así como cepas heterocariotas con núcleos heteroploides) , y cepas que tienen diferentes tipos de apareamiento, es decir mutuamente fértiles, se diferencian en la ploidía nuclear (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). La diversidad de núcleos en anteridios y ovogonias puede ser la razón de la baja fertilidad.
En cuanto a los intercambios nucleares entre hifas durante las anastomosis, esto se evita por la incompatibilidad vegetativa, que divide las poblaciones asexuales en muchos clones aislados genéticamente (Poedinok y Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Convergencia de poblaciones. Los datos anteriores indican que es posible la hibridación entre cepas de P. infestans "patata" y "tomate". También es posible la reinfección recíproca de diferentes huéspedes, aunque con una agresividad reducida.
Un estudio de marcadores poblacionales en aislamientos de campos de papa y tomate adyacentes en 1993 mostró que aproximadamente una cuarta parte de los aislamientos de hojas de tomate fueron transferidos de un campo de papa vecino (Dolgova et al., 1997). Teóricamente, se podría suponer que la divergencia de poblaciones en dos hospedantes aumentaría y conduciría a la aparición de formas intraespecíficas especializadas (p.sp. papa y p.p. tomate), especialmente porque las oosporas pueden persistir en los desechos vegetales (Drenth et al., 1995). ; Bagirova, Dyakov, 1998) y semillas de tomate (Rubin et al., 2001). En consecuencia, los tomates tienen actualmente una fuente de regeneración primaveral independiente de los tubérculos de papa.
Sin embargo, todo sucedió de manera diferente. Pasar el invierno con oosporas permitió al parásito evitar la etapa más estrecha de su ciclo de vida: la etapa monocíclica de la vegetación en el suelo, durante la cual disminuyen las propiedades parasitarias, que se restauran gradualmente en la fase policíclica en verano.
Cuadro 11. Frecuencias de genes de virulencia para variedades diferenciadoras de papa en cepas de P. infestans
país | Año | Número medio de genes de virulencia en cepas | autor | |
de patatas | de tomate | |||
Francia | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton y col., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francia, Suiza | 1996 - 97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
Estados Unidos | 1989 - 94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
Estados Unidos, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993 - 95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzún et al., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusia, Mosk. región | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusia, diferentes regiones | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya y otros. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Los zoosporangios primarios y las zoosporas, que germinan oosporas, tienen un alto grado de actividad parasitaria, especialmente si las oosporas se formaron partenogenéticamente bajo la influencia de feromonas de una cepa con el tipo opuesto de apareamiento. Por lo tanto, el material infeccioso de las plántulas de tomate que crecen a partir de semillas infectadas con oosporas es altamente patógeno tanto para el tomate como para la papa.
Estos cambios llevaron a otra reestructuración poblacional, expresada en los siguientes cambios importantes desde el punto de vista epidemiológico:
- Las plántulas de tomate infectadas se han convertido en una fuente importante de infección primaria de las patatas (Filippov, Ivanyuk, mensajes personales).
- Las epifitias en las papas comenzaron a observarse ya en junio, aproximadamente un mes antes de lo habitual.
- En las plantaciones de papa aumentó el porcentaje de la raza T1, que anteriormente se encontraba allí en una cantidad insignificante (Ulanova et al., 2003).
- Las cepas aisladas de hojas de tomate dejaron de diferir de las cepas de papa en virulencia en los diferenciadores de genes de virulencia de papa y comenzaron a superar a las cepas de “papa” en agresividad no solo en tomate, sino también en papa (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Así, en lugar de divergencia, hubo una convergencia de poblaciones, el surgimiento de una sola población sobre dos plantas hospedadoras con alta virulencia y agresividad para ambas especies.
Conclusión
Entonces, a pesar de más de 150 años de estudio intensivo de P. infestans, en biología, incluida la biología poblacional de este agente causante de las enfermedades más importantes de las plantas solanáceas cultivadas, queda mucho por conocer. No está claro cómo el paso de etapas individuales del ciclo de vida afecta la estructura de las poblaciones, cuáles son los mecanismos genéticos de la variabilidad canalizada de agresividad y virulencia, cuál es la proporción de los sistemas reproductivo y de reproducción clonal en poblaciones naturales, cómo se hereda la incompatibilidad vegetativa, cuál es el papel de la papa y el tomate en la infección primaria de estos cultivos y en cuál es su efecto sobre la estructura poblacional del parásito. Hasta ahora no se han resuelto cuestiones prácticas tan importantes como los mecanismos genéticos para modificar la agresividad del parásito o la erosión de la resistencia inespecífica de la papa. Con la profundización y expansión de la investigación sobre el tizón tardío de la papa, el parásito plantea nuevos desafíos a los investigadores. Sin embargo, la mejora de las capacidades experimentales, la aparición de nuevos enfoques metodológicos para la manipulación con genes y proteínas nos permiten esperar una solución exitosa de las cuestiones planteadas.
El artículo fue publicado en la revista "Potato Protection" (No. 3, 2017)